C. Polyacrylamide Noyé de billes fluorescentes
Comme décrit dans la section précédente, les substrats de silicium se sont révélés précieux pour mesurer les forces exercées par les kératocytes en mouvement rapide. Cependant, ces mêmes substrats sont beaucoup moins utiles pour étudier la plupart des cellules de mammifères. Pour que les tractions soient calculées avec précision, le substrat doit être réglé pour correspondre à la motilité et à la génération de force d’un type de cellule donné. Il est difficile de réaliser avec précision un substrat de silicium de la conformité souhaitée pour des cellules plus lentes capables d’exercer des forces plus élevées. Pour surmonter cette limitation, Dembo et Wang (1999) ont utilisé un substrat de polyacrylamide noyé de billes fluorescentes de la taille d’un micromètre. La conformité des substrats de polyacrylamide peut être réglée chimiquement en faisant varier les concentrations de monomères et de réticulants (Pelham et Wang, 1997). Le polyacrylamide offre plusieurs avantages supplémentaires par rapport aux substrats de silicium. Sur une large gamme de déformations, il présente un comportement linéairement élastique. De plus, le polyacrylamide ne se prête généralement pas à la liaison cellulaire par lui-même, sans la conjugaison de ligands d’adhésion cellulaire spécifiques (Nelson et al., 2003). C’est donc un échafaudage parfait pour étudier l’adhérence et le comportement des cellules de manière contrôlable et définie.
La méthode de calcul par laquelle des déformations dans le substrat sont utilisées pour déterminer les tractions exercées par la cellule est très similaire aux méthodes utilisées sur les substrats de silicium sollicités précités. Cependant, l’utilisation de marqueurs fluorescents a grandement amélioré la méthode de suivi et la capacité de calculer un champ de déformation précis.
Dembo et Wang ont publié plusieurs études utilisant la technique résultante, la microscopie à force de traction, qui élucident les mécanismes de la migration des fibroblastes. Plus précisément, ils ont montré que les lamellipodes de la cellule fournissent la quasi-totalité de la force nécessaire à la locomotion vers l’avant (Munevar et al., 2001a). Leurs résultats indiquent que le lamellipodium est une entité mécanique distincte du reste du corps cellulaire. Fait intéressant, cette même division mécanique au sein de la cellule ne semble pas exister dans les cellules transformées en H-ras, ce qui explique peut-être la différence dans leur comportement mobile. De plus, Beningo et coll. (2001) ont étudié le rôle des adhérences focales dans la régulation de la génération de traction et ont constaté que la taille des adhérences focales est inversement liée à la quantité de force générée. De plus, la répartition des adhérences ne correspond pas bien à la répartition des efforts de traction. Les auteurs concluent que ces résultats peuvent indiquer que les complexes focaux précoces sont responsables de fortes forces propulsives, et la maturation de ces sites d’adhésion entraîne un changement en sites d’ancrage passifs — une conclusion qui a été largement discutée dans la littérature. De plus, Dembo et ses collègues ont étudié les rôles dynamiques des adhérences avant contre arrière (Munevar et al., 2001b), la myosine IIb (Lo et al., 2004), kinase d’adhérence focale (Wang et al., 2001), et les canaux Ca2+ activés par étirement jouent dans la migration des fibroblastes (Munevar et al., 2004). En utilisant la microscopie de force de traction, Dembo et ses collègues ont fait des progrès significatifs dans la compréhension du rôle de la génération de force dans la migration des fibroblastes.
L’une des avancées techniques les plus significatives utilisant le gel de polyacrylamide est la capacité de contrôler de manière fiable la conformité du substrat cellulaire sans modifier la densité ECM. Le réglage de la conformité du substrat a été un tournant critique dans le développement de la microscopie à force de traction, car il a permis d’étudier presque tous les types de cellules et de comprendre le comportement des cellules en fonction de l’environnement mécanique. Avant l’étude de Pelham et Wang (1997), la plupart des études portant sur la migration cellulaire et l’adhésion se concentraient sur la migration cellulaire en réponse à son environnement chimique soluble (chimiotaxie) ou en réponse au ligand conjugué au substrat (haptotaxie). De plus, les études portant sur l’environnement mécanique de la cellule se sont concentrées sur la réponse due aux forces imposées telles que la contrainte de cisaillement du fluide et l’étirement mécanique. Cependant, en modifiant la rigidité du substrat, Pelham et Wang (1997) ont créé un changement significatif dans la façon dont les chercheurs abordent la réponse cellulaire et la mécanotransduction. En utilisant des substrats de polyacrylamide, Pelham et Wang ont maintenu la densité ECM sur le substrat constante tout en modifiant la conformité mécanique. Ils ont démontré que les fibroblastes sont capables de répondre activement à la compliance mécanique de leur substrat. Les cellules des gels plus rigides sont plus étalées et migrent plus lentement que les cellules des gels plus conformes. De plus, la capacité des cellules à détecter la conformité mécanique de leur substrat se reflète dans leur capacité à modifier l’état de phosphorylation de nombreuses protéines contenues dans la structure d’adhésion focale. Les adhérences focales sur les substrats rigides sont plus grandes, plus allongées et plus stables, tandis que les adhérences focales sur les substrats plus conformes contiennent moins de pp125FAK phosphorylé et de paxilline et apparaissent beaucoup plus irrégulièrement. Ces résultats ont été les premiers à suggérer que les signaux d’ECM mécaniques peuvent être tout aussi importants que les signaux chimiques dans la régulation de l’adhérence cellulaire.
Depuis l’article fondateur de Pelham et Wang (1997), un certain nombre d’études ont étudié les effets de la compliance sur le comportement cellulaire. Lo et coll. (2000) ont utilisé la chimie du polyacrylamide pour créer un substrat contenant une étape de rigidité — une région centrale du substrat où deux substrats de conformités différentes se rencontrent. Ils ont démontré un comportement appelé durotaxis, par lequel les cellules étaient capables de détecter activement et de réagir aux changements de conformité du substrat. Les cellules qui migraient sur le substrat mou, en heurtant la limite de la transition rigide–douce, se croisaient sur le substrat rigide, tandis que les cellules sur des substrats rigides présentaient des tractions plus élevées et une plus grande surface d’étalement, et se rétractaient ou changeaient de direction en réponse à la limite rigide–douce. Plus tard, Wong et coll. (2003) ont étudié la capacité des fibroblastes à migrer sur des hydrogels de polyacrylamide contenant des gradients de compliance, plutôt qu’une étape, comme l’ont fait Lo et ses collègues. Ils ont constaté que les cellules musculaires lisses vasculaires ont tendance à migrer plus rapidement sur des substrats plus mous que sur des substrats plus rigides (15 kPa vs 25 kPa), et que les cellules ont tendance à s’accumuler sur des substrats plus rigides. De plus, le schéma de migration sur les gels conformes aux gradients semblait être dirigé vers les régions de gel plus rigides plutôt que de présenter le schéma de marche aléatoire typique de la migration cellulaire. Engler et coll. (2004) ont étudié plus avant la réponse cellulaire aux gels conformes et ont montré que la réponse est en grande partie médiée par l’assemblage du cytosquelette d’actine. En testant les modifications du cytosquelette, Engler et ses collègues ont pu montrer qu’une légère surexpression de l’actine dans la cellule peut compenser la perte de propagation observée dans les réponses au gel mou. De plus, Yeung et coll. (2005) ont montré que le seuil de sensibilité pour la détection de conformité est spécifique au type cellulaire et que les contacts cellule–cellule peuvent également aider à sauver les changements morphologiques observés dans les substrats mous pour ressembler davantage à la morphologie des cellules sur des substrats plus rigides (Yeung et al., 2005). Dans l’ensemble, l’étude de la durotaxie est encore relativement jeune et il reste beaucoup à apprendre sur la façon dont une cellule détecte et réagit mécaniquement aux propriétés matérielles de son substrat et de son environnement.
