2.3.4.1 La structure
De l’homodimère apo-sCTLA-4 a été exprimée sous la forme d’une protéine de fusion Fc clivable par thrombine dans les cellules CHO en présence de kifunensine.23 Après la déglycosylation, l’homodimère a donné des cristaux diffractant à des espacements de Bragg de 1,8 Å, avec des dimensions unitaires des cellules de a = 43,86 Å, b = 51,46 Å et c = 102,85 Å, et le groupe d’espace P212121 (Réf. 130). La structure a été résolue par remplacement moléculaire. L’unité asymétrique comprenait un homodimère lié au disulfure permettant des comparaisons avec les complexes sCTLA-4 / sB7-1 et sCTLA-4 / sB7-2, et avec sCTLA-4 lié à une lipocaline d’ingénierie.131
Les deux monomères de l’unité asymétrique étaient composés de domaines β-sandwich avec une topologie AGFCC’ et ABED comme prévu par Metzler et al.132 Une courte « tige » de huit résidus liée au disulfure à Cys122 a relié les domaines IgSF à la membrane. De façon inattendue, les deux moitiés de l’homodimère apo-CTLA-4 étaient moins semblables l’une à l’autre qu’à leurs homologues complexés, soulignant que la liaison ne s’accompagne pas de réarrangements structurels à grande échelle (Fig. 2.2H). Des comparaisons automatisées de structures ont identifié CD28 et PD-1 comme les structures les plus similaires à CTLA-4. Les différences importantes entre CTLA-4 et CD28 étaient: (i) la présence d’un pli dans le brin β G de CD28, (ii) des changements de taille de boucle comprenant des boucles AB, BC et CC’ étendues dans CTLA-4 et une boucle C « D tronquée, et (iii) la liaison en H des brins C ‘ et C » β résultant du repositionnement de la boucle C’ C » dans CD28. La conformation en grande partie identique de la séquence 99MYPPPY104 de la boucle FG formant le noyau de leurs surfaces de liaison aux ligands était d’une importance capitale. Une seule molécule d’eau a pu être trouvée dans la surface de liaison au ligand inhabituellement sèche de l’apo-CTLA-4, alors que 228 eaux ont été détectées ailleurs.
Après CD28 et PD-1, les structures les plus similaires au domaine V-set CTLA-4 étaient les domaines V-anticorps 215 ou TCR, différant principalement par la longueur des boucles uniquement. La différence r.m.s. pour la superposition de CTLA-4 avec le domaine Va TCR le plus similaire était de 2,09 Å pour 102 résidus, contrastant avec 2,89 Å pour 86 résidus pour la superposition avec d1 de CD2. D’importantes caractéristiques communes avec le domaine Va comprenaient la longue boucle CC’ et des renflements β conservés dans les brins C ‘ et G β imposant une torsion prononcée sur la feuille AGFCC’β. Le degré élevé de conservation de la séquence et de conformation Ca près du renflement β du brin G, c’est-à-dire GNGTQIYV (CTLA-4) et GDGTQLVV (Va), est particulièrement remarquable. Dans CD2 et CTLA-4, les boucles étaient similaires, et les domaines différaient dans la mesure où: (i) dans CD2, il n’y avait pas de liaison H des brins ßA et ßB, (ii) il n’y avait pas de torsion de la feuille β A’GFCC’ dans CD2 en raison du repositionnement des renflements β, (iii) la position du brin β C « dans CD2 mais pas CTLA-4 permettait une liaison H canonique et une extension de la feuille β AGFCC’C », et (iv) CTLA-4 manquait de torsion dans la boucle FG présente dans CD2 (et aussi, par exemple, B7 – 1). L’analyse de cinquante-deux domaines IgSF de l’ensemble V à l’aide d’un programme d’alignement séquentiel de structure133 a indiqué que la famille CD28/CTLA-4 comprend un sous-groupe de domaines de l’ensemble V distincts des groupements de CD8, de récepteurs d’antigènes et de molécules « d’adhésion », par example B7-1 et CD2. Dans l’ensemble, il y avait une plus grande similitude du sous-groupe CD28 / CTLA-4 avec la famille des récepteurs antigéniques, par rapport à l’ensemble d’adhésion. L’analyse a suggéré que les protéines de la famille CD28/ CTLA-4 et les récepteurs antigéniques partageaient un ancêtre commun probablement similaire à PD-1, les deux familles divergeant tôt.
Apo-CTLA-4 comprend un homodimère dont les sous-unités adoptent un agencement favorisant les interactions bivalentes orthogonales avec des ligands positionnés sur des surfaces cellulaires apposantes. Les comparaisons avec les paires de monomères CTLA-4 dans les complexes B7-1 et B7-2106, 107 et le monomère dans le complexe de lipocaline 131 ont révélé une flexibilité de rotation très limitée à l’interface homodimère et remarquablement peu, voire aucune, de changements attribuables à la liaison au ligand. Les seules différences étaient apparentes dans le complexe B7-2, avec un léger repositionnement des boucles BC et CC’, et du brin β C » et des boucles voisines, et des différences conformationnelles dans le brin β G à son extrémité C. Ces variations locales étaient éloignées du site de liaison au ligand de CTLA-4 et en aucun cas les monomères apo ne différaient systématiquement des cinq monomères CTLA-4 complexés. Les positions des atomes de la chaîne principale de la séquence 99MYPPPY104 étaient essentiellement identiques.
Les structures des complexes formés par CTLA-4 avec B7-1 et B7-2, qui n’avaient pas été comparées auparavant, étaient très différentes.130 La substitution en B7-2, de Val28 vs Arg29 en B7-1, a formé une poche de liaison en B7-2 qui n’a été remplie qu’en partie par CTLA-4. Cela garantissait que le complexe B7-1/ CTLA-4 présentait une meilleure complémentarité de forme que le complexe B7-2/ CTLA-4. En compensant légèrement cela, la surface enterrée dans B7-2 par CTLA-4 était un peu plus grande que celle de B7-1. Globalement, B7-1 a lié CTLA-4 de manière encore plus rigide que CTLA-4 a engagé B7-1. La liaison B7-2 par CTLA-4 était cependant plus complexe et portait la marque de « l’ajustement induit. »Dans CTLA-4 bound-vs apo-B7-2, il y a eu un décalage de 2,3 à 3,5 Å de la boucle FG B7-2 vers CTLA-4, qui a été initié par une rotation de ~ 120 degrés de Phe31 de B7-2 (Réf. 130). Ceci a produit une interaction d’empilement de Phe31 avec Pro102 de la séquence 99MYPPPY104 de CTLA-4.
