Kluyveromyces marxianus développer une tolérance à l'éthanol au cours de l'évolution adaptative avec des améliorations significatives des voies multiples | Biotechnologie pour les biocarburants

Résistance améliorée à l’éthanol après une évolution de 100 jours
L’analyse de l’ADN suggère que K. marxianus n’a aucun changement de ploïdie ou de gènes critiques au cours de l’évolution adaptative
Un recâblage global induit par l’évolution de 100 jours
KM-100d utilisation améliorée de l’éthanol
biosynthèse des lipides membranaires améliorée KM-100d, pression anti-osmotique, stress antioxydant et repliement des protéines pour résister au stress de l’éthanol
Validation de la consommation accrue d’éthanol et de la résistance aux contraintes multiples dans KM-100d

Résistance améliorée à l’éthanol après une évolution de 100 jours

La souche haploïde K. marxianus de type sauvage a été cultivée dans un milieu contenant 6% (v /v) d’éthanol à 30 °C pendant 100 jours environ 450 générations (voir Méthodes pour plus de détails). Il y a eu une augmentation continue de la biomasse (mesurée par OD600 quotidiennement) pendant cette période (Fig. 1a), indiquant que la survie des cellules sous stress éthanol peut être améliorée. À la fin, nous avons obtenu une population de K. marxianus avec une résistance grandement améliorée à l’éthanol (Fig. 1b). Dans l’ensemble, KM fait référence à la souche brute avant l’évolution, et KM-100d fait référence à la population de K. marxianus après l’évolution de 100 jours. La résilience maximale de l’éthanol pour KM était de 7% (v / v) et pour KM-100d, elle était jusqu’à 10% (Fig. 1b). Nous avons comparé les profils de croissance entre KM et KM-100d dans des milieux de culture avec différents niveaux d’éthanol (0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v/v, Fig. 1c). En l’absence d’éthanol, il n’y avait pas de différence significative entre les souches. Leur différence a augmenté avec l’augmentation du taux d’éthanol et a atteint le maximum avec 6% (v / v) d’éthanol dans les milieux de culture. Dans de telles circonstances, après 48 h, la biomasse de KM-100d était presque deux fois plus élevée que celle de KM. Les deux souches ont montré une croissance retardée dans un milieu contenant 7% d’éthanol et n’ont pas réussi à croître dans le milieu contenant 8% d’éthanol. De plus, le KM-100d a également montré un taux de croissance maximal remarquable plus élevé que le KM à 6% d’éthanol (fichier supplémentaire 1: Figure S1).

L’analyse de l’ADN suggère que K. marxianus n’a aucun changement de ploïdie ou de gènes critiques au cours de l’évolution adaptative

Pour élucider les altérations de l’ADN dans KM-100d, nous avons effectué une analyse de ploïdie de l’ADN et une identification de la mutation de l’ADN. Au cours de l’évolution adaptative, le contenu en ADN de la population de K. marxianus a peu changé (fichier supplémentaire 1: Figure S2); ainsi, aucun changement de ploïdie n’a eu lieu. Par analyse ADN-seq de KM et KM-100d, qui ont tous deux été cartographiés sur le génome de référence de K. marxianus DMKU 3-1042, les sites SNP entre KM et KM-100d ont été obtenus (fichier supplémentaire 2). Parmi les 57 SNP identifiés, seuls 4 sites dominaient la population KM-100d. Trois d’entre eux sont situés dans la région codante des gènes SAN1, YAP1 et KHT2; l’autre est à 445 pb en amont d’ERG26. Le site 1324 de SAN1 a été muté de C à T, et par conséquent l’acide aminé correspondant a été transformé de l’arginine en cystéine. Cependant, selon l’analyse du Pfam 32.0, cette mutation ne tombe dans aucun domaine protéique identifié. Les mutations de YAP1 et KHT2 sont synonymes de mutations sans changement de protéine. Les résultats ci-dessus suggèrent que les changements dans le contexte de l’ADN sont loin d’être suffisants pour soutenir une telle amélioration du phénotype dans KM-100d, et la reprogrammation transcriptionnelle doit y contribuer. Par conséquent, nous avons également effectué une analyse ARN-seq.

Un recâblage global induit par l’évolution de 100 jours

Pour bien comprendre la tolérance à l’éthanol, nous avons effectué une analyse ARN-seq pour comparer les expressions géniques des levures KM et KM-100d qui ont poussé dans des milieux contenant 4% et 6% (v/v) d’éthanol. Sur la base des profils de croissance (Fig. 1c), il a été observé que la capacité de croissance entre KM-100d et KM avait la différence maximale à 48 h; par conséquent, des échantillons à 48 h ont été collectés pour l’analyse ARN-seq. Réglage /log2ratio/≥ 1 et valeur p < 0.05 comme critère pour définir des gènes (DE) différentiellement exprimés significatifs, nous avons effectué l’identification du gène DE dans sept groupes (Fig. 2, noté comme 1, 2, 3, 4, 5, 6, et 7, respectivement). Dans chaque groupe, l’analyse DE a été effectuée selon la flèche pointant vers le contrôle. Le fichier supplémentaire 3 fournit les valeurs d’expression et les statistiques d’expression différentielle de tous les gènes. Il existe une différence d’expression globale entre KM et KM-100d lorsque les deux ont grandi dans un milieu sans éthanol (Fig. 2 Groupe ①). Les levures KM-100d ont 1342 gènes avec une expression plus élevée que celle de la levure KM, tandis que seulement 188 gènes ont une expression plus faible. Dans les milieux contenant 4% et 6% (v / v) d’éthanol, le nombre de gènes régulés à la hausse dans KM-100d est considérablement réduit à 415 (Groupe ②) et 453 (Groupe ③), respectivement. Cependant, le nombre de gènes régulés à la hausse est encore beaucoup plus élevé que ceux dont l’expression est plus faible (104 et 182 gènes, respectivement). Ces résultats suggèrent que les levures KM-100d sont recâblées transcriptionnellement en activant un grand nombre de gènes. La suggestion a été étayée par les changements d’expression induits par l’éthanol dans les levures KM et KM-100d. Sous induction d’éthanol à 4% et 6% (v / v), les levures KM ont 1452 et 1465 gènes régulés vers le haut (Groupes ④ et ⑦) tandis que les levures KM-100d n’ont que 631 et 596 gènes régulés vers le haut (Groupes ④ et ⑤), respectivement. De plus, nous avons appliqué heatmap.2 logiciel dans le paquet R pour regrouper les gènes et les groupes en fonction des valeurs de log2ratio (fichier supplémentaire 1: Figure S3) et a constaté que le profil d’expression différentielle des gènes dans le Groupe ① est proche de celui du Groupe ⑦. Prises ensemble, les levures KM-100d ont conservé de nombreuses caractéristiques d’expression induites par l’éthanol même si elles ont grandi dans un milieu sans éthanol. Les caractéristiques rendent la cellule évoluée plus adaptative à la stimulation à l’éthanol à venir, c’est-à-dire que la levure KM-100d n’a pas besoin d’activer autant de gènes que KM.

Par la suite, dans chaque groupe, nous avons effectué une analyse d’enrichissement en ontologie génique (GO) pour les gènes DE (fichier supplémentaire 1: Figure S4), et a constaté que les termes GO enrichis couvraient un large éventail de processus physiologiques de base cellulaires, y compris la biogenèse des ribosomes, la biosynthèse des acides aminés, la réparation de l’ADN, le traitement de l’ARN, etc., mais pas directement pertinent pour la résistance à l’éthanol. Par conséquent, dans ce qui suit, nous nous sommes particulièrement concentrés sur les voies fortement associées au métabolisme et à la tolérance de l’éthanol, en analysant les gènes DE associés (fichier supplémentaire 4).

KM-100d utilisation améliorée de l’éthanol

Pour faciliter l’illustration graphique, les valeurs log2ratio des gènes DE impliqués (fichier supplémentaire 4) ont été subdivisées en cinq intervalles: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 ( et ci-dessus), comme le montre la Fig. 3.

La différence entre KM et KM-100d dans la consommation d’éthanol a été étudiée. Comme illustré à la Fig. 3, deux voies peuvent exister pour consommer directement de l’éthanol et ont toutes deux été régulées en KM et en KM-100d face à l’éthanol (groupes ④, ⑤, ⑥ et ⑦). L’un des moyens consiste à utiliser l’ADH6 cytoplasmique, qui catalyse l’éthanol en acétaldéhyde, facilité par le NADP +. L’autre est par ATF1 mitochondrial, qui favorise l’estérification de l’éthanol à l’aide d’acétyl-CoA. En particulier, dans KM-100d sous contrainte d’éthanol (groupes ④ et ⑤), YGL039W a été régulé pour générer plus de NADP + et peut donc fournir plus de coenzymes pour convertir l’éthanol en acétaldéhyde afin de réduire la toxicité de l’éthanol. Dans les mitochondries, pour les KM exposés au stress éthanol (groupes ⑥ et ⑦), seuls le C2E1P301 et l’ADH4 ont été régulés à la hausse. Pendant le KM-100d, pendant le processus de l’éthanol à l’aldéhyde en acétate, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 et ALD6 ont tous été régulés à la hausse (groupe ①). Les changements susmentionnés indiquent que le KM-100d pourrait acquérir une nouvelle capacité à atténuer la toxicité de l’éthanol en augmentant la consommation d’éthanol. La théorie explique que KM-100d a effectué plus de KM en milieu avec de l’éthanol.

biosynthèse des lipides membranaires améliorée KM-100d, pression anti-osmotique, stress antioxydant et repliement des protéines pour résister au stress de l’éthanol

En plus d’être consommé, l’éthanol accumulé influence directement l’intégrité de la membrane cellulaire, modifie la pression osmotique interne et externe, perturbe la conformation des protéines et induit la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), causant ainsi de graves dommages aux cellules de levure. Dans ce qui suit, nous avons analysé les gènes DE dans ces voies pour détecter les dommages causés par l’anti-éthanol chez K. marxianus (Fig. 4).

Après une évolution pilotée par l’éthanol, la voie de réponse au stress lié à l’alcool dans KM-100d a été activée. ASR1, qui se transfère du cytoplasme au noyau lors de l’exposition à l’éthanol, et ETP1, qui agit comme une protéine de rétention cytoplasmique jouant un rôle dans l’activation transcriptionnelle dépendante de l’éthanol des gènes des protéines de choc thermique, ont tous deux été régulés à la hausse dans KM-100d (Groupe ①), et partiellement régulés dans KM face à l’éthanol (groupes ⑥ et ⑦), suggérant que même dans un milieu sans éthanol, KM-100d peut préparer des voies réactives pour le défi de l’éthanol, tout comme la réponse de KM à l’éthanol.

La formation de lipides membranaires joue un rôle important dans le maintien de l’intégrité de la membrane cellulaire sous contrainte d’éthanol. Les acides gras insaturés, les composants clés de la structure de la membrane cellulaire, sont étroitement liés à la tolérance à l’éthanol. Illustré à la Fig. 4, de l’acétyl-CoA à la biosynthèse des acides gras insaturés jusqu’à l’incorporation dans les phospholipides, les gènes impliqués PPT2, FAD2 et TAZ1 ont tous été régulés à la hausse dans KM-100d (groupe ①), suggérant qu’après l’évolution, KM-100d peut déjà améliorer la biosynthèse des acides gras insaturés pour fournir plus de matières premières pour la biogenèse des membranes cellulaires. Et la régulation à la baisse des gènes ACC1, TSC13, FAS1 en KM exposés dans l’éthanol (groupes ⑥ et ⑦) est conforme au rapport précédent, ce qui pourrait expliquer la faible tolérance à l’éthanol de K. marxianus avant l’évolution adaptative.

Un grand nombre de gènes associés à la biogenèse des lipides de la membrane cellulaire, y compris le phosphoglycéride, le sphingolipide et le stérol, ont été exprimés de manière différentielle sous stress éthanol (Fig. 4). En particulier, les gènes impliqués dans la biosynthèse des phosphoglycérides ont généralement été régulés à la hausse dans le KM-100d (Groupe ①) et dans l’éthanol à face KM (groupes ⑥ et ⑦), ce qui indique que le phosphoglycéride peut être le composant majeur de la membrane cellulaire pour la résistance à l’éthanol. Pour la biosynthèse des stérols, de nombreux gènes (par exemple, ERG9 et ERG7) ont été régulés à la baisse dans les groupes ④ et ⑥, et plusieurs gènes ont été régulés à la hausse dans les groupes ERG (par exemple, ERG25) et Group (par exemple, ERG26), suggérant que la biogenèse des stérols peut être importante pour supporter un taux élevé d’éthanol, mais pas pour un taux faible d’éthanol. De plus, les gènes CKI1, ERG2 et ERG25, impliqués dans la biosynthèse des phosphoglycérides et des stérols, n’ont été régulés que dans le groupe ⑤; c’est peut-être l’un des indices des meilleures performances du KM-100d que du KM dans un taux élevé d’éthanol.

Une concentration élevée d’éthanol dans un milieu impose un stress osmotique aux cellules de levure. Comme le montre la Fig. 4, les capteurs osmotiques de la membrane plasmique (SLN1, OPY2 et SHO1) et les gènes (HOG1, SSK1 et SSK2) impliqués dans la voie réactive en aval ont tous été régulés en KM exposés dans un faible taux d’éthanol (Groupe ⑥), et individuellement régulés en KM-100d (Groupe ①), en KM-100d face à l’éthanol (Groupes ④ et ⑤) et en KM face à un taux élevé d’éthanol (Groupe ⑦). La production de glycérol est un moyen majeur pour S. cerevisiae de résister à la pression osmotique. Lorsque KM et KM-100d faisaient face à l’éthanol, la plupart des gènes liés à la biogenèse du glycérol étaient régulés à la baisse. Les résultats ci-dessus suggèrent qu’avant et après l’évolution, K. marxianus améliore toujours les voies de détection et de transduction des signaux de stress osmotique; cependant, sa stratégie de résistance au stress osmotique peut ne pas dépendre de la voie de production de glycérol, il doit exister d’autres moyens.

La paroi cellulaire fournit une résistance mécanique suffisante pour que la cellule résiste à la pression osmotique, et la voie sécrétoire transporte non seulement les protéines de la paroi cellulaire vers l’extérieur, mais transfère également les lipides sur la membrane plasmique pour fortifier la structure de la membrane; par conséquent, ces deux processus peuvent être responsables du stress anti-osmotique. Nous avons analysé les gènes DE dans la voie sécrétoire et la biogenèse de la paroi cellulaire (fichier supplémentaire 1: Figure S5). Les gènes impliqués dans la voie sécrétoire et la biogenèse de la paroi cellulaire étaient généralement régulés à la hausse dans le KM-100d (Groupe ①), et certains d’entre eux étaient également régulés à la hausse dans le KM exposé à l’éthanol (Groupes ⑥ et ⑦). Cela implique que le KM-100d a non seulement maintenu la régulation ascendante de la voie sécrétoire pour le KM résistant au stress de l’éthanol, mais a également largement élargi la portée d’activation de la voie sécrétoire pour se préparer à l’attaque de l’éthanol; par conséquent, l’amélioration de la voie sécrétoire et de la formation de la paroi cellulaire pourrait être la nouvelle stratégie développée par KM-100d pour supporter le stress osmotique causé par l’éthanol. D’autre part, pour KM et KM-100d exposés dans un faible taux d’éthanol (groupes ④ et ⑥), de nombreux gènes de la voie sécrétoire étaient tous deux régulés à la baisse, suggérant que l’activation de la voie sécrétoire n’est peut-être pas la voie nécessaire pour que K. marxianus réponde à un faible taux d’éthanol.

Pour lutter contre le stress oxydatif déclenché par l’éthanol (Fig. 4), HYR1, qui fonctionne comme un capteur et un transducteur de la contrainte hydroperoxyde, a été régulé en KM et en KM-100d, tous deux exposés à un taux élevé d’éthanol (groupes ⑤ et ⑦). Les facteurs de transcription sensibles au stress oxydatif SKN7 et STB5 ont été régulés à la hausse dans KM-100d (Groupe ①) et dans KM face à un taux élevé d’éthanol (Groupe ⑦). Pour le stress antioxydant, les gènes impliqués dans le système de superoxyde dismutase (par exemple, MTM1 et PRX1) ont généralement été régulés à la hausse dans KM-100d, exposés ou non dans l’éthanol (groupes ①, ④ et ⑤). Pour le système thiorédoxine, les gènes (p. ex., MXR1 et TRR1) ont été régulés à la hausse en KM et en KM-100d face à l’éthanol. On a également signalé que la thiorédoxine et sa réductase amélioraient la tolérance de K. marxianus à de multiples inhibiteurs dérivés des lignocelluloses. Pour le système glutarédoxine, les gènes GRX2 et GLR1 n’ont été régulés que dans le KM-100d exposé à une teneur élevée en éthanol (groupe ⑤). Pour la biogenèse du peroxysome, des gènes tels que PEX6 et PEX7 ont été régulés à la hausse en KM-100d (Groupe ①), et certains autres gènes (PEX3 et INP2, par exemple) ont été régulés à la baisse en KM et KM-100d lorsqu’ils étaient confrontés à une faible teneur en éthanol (groupes ④ et ⑥). Ce qui précède implique que le KM-100d peut renforcer globalement la capacité anti-oxydation.

Pour assurer un repliement correct des protéines sous contrainte d’éthanol (Fig. 4), le facteur de transcription du choc thermique HSF1 a été régulé en KM et KM-100d a fait face à un faible taux d’éthanol (Groupes ④ et ⑥), un certain nombre de gènes liés au chaperon (par exemple PFD1 et CPR7) ont été régulés en KM face à l’éthanol (Groupes ⑥ et ⑦), également maintenu en régulation en KM-100d (Groupe ①). Certains gènes (p. ex. CPR4) régulés à la baisse dans l’éthanol KM face n’étaient pas régulés à la baisse dans KM-100d. Par conséquent, le KM-100d peut généralement améliorer le repliement des protéines pour fournir un environnement cellulaire plus stable.

Il a été rapporté que chez S. cerevisiae, l’accumulation de tréhalose était importante pour la tolérance à l’éthanol, en raison du fait que le tréhalose agissait comme soluté compatible pour empêcher l’afflux d’excès de sels dans les cellules de levure; pendant ce temps, les gènes impliqués dans la dégradation du tréhalose étaient également induits par l’éthanol, pour l’ajuster à la concentration optimale. Pour K. marxianus (Fig. 4), nous avons constaté que les gènes participant à la biosynthèse et à la dégradation du tréhalose (p. ex., NTH1 et TSL1) étaient généralement régulés à la hausse lorsqu’ils étaient traités avec un faible taux d’éthanol (Groupes ④ et ⑥), mais pas régulés à la hausse dans le métabolisme du tréhalose lorsqu’ils étaient exposés à un taux élevé d’éthanol (Groupes ④ et ⑦). Cela suggère que chez K. marxianus, l’accumulation de tréhalose peut être une stratégie spéciale pour faire face à une faible teneur en éthanol, mais pas pour une teneur élevée en éthanol.

Les expressions différentielles de 15 gènes impliqués dans les voies tolérantes à l’éthanol ci-dessus ont été validées par analyse RT-qPCR (Fig. 5). Expressions des gènes dans le groupe ① (Fig. 5a) étaient généralement réglementées à la hausse. D’autre part, la régulation ascendante des gènes du groupe ④ (Fig. 5d) et le groupe ⑤ (Fig. 5e) n’était pas aussi haut que dans le groupe ⑥ (Fig. 5b) et le groupe ⑦ (Fig. 5c). Notre analyse a confirmé que les gènes contribuant à la tolérance à l’éthanol sont activés en continu dans KM-100d même après le retrait du stress de l’éthanol. L’expression continue des gènes pourrait être utile pour stabiliser l’environnement intracellulaire et bénéficier à la croissance des cellules lors d’un stress à venir.

Validation de la consommation accrue d’éthanol et de la résistance aux contraintes multiples dans KM-100d

Nous avons vérifié la croissance des levures KM et KM-100d en milieu YNB avec différentes sources de carbone (Fig. 6 bis). Les levures KM et KM-100d ont toutes les deux la même capacité à utiliser le glucose comme seule source de carbone. Cependant, en présence d’éthanol à 1% et 2% (v / v) comme seule source de carbone, les levures KM-100d ont mieux poussé que les levures KM. Le résultat confirme notre hypothèse susmentionnée selon laquelle les levures KM-100d utilisaient l’éthanol plus efficacement que les levures KM.

D’autre part, sur la base de la Fig. 4, KM-100d peut développer une résistance aux contraintes multiples causées par l’éthanol simultanément, y compris le stress osmotique, le stress oxydatif et le stress thermique (pour les protéines de choc thermique prises comme chaperons pour le repliement des protéines). Pour évaluer les tolérances des levures à de multiples contraintes, nous avons effectué le test de viabilité cellulaire pour différentes pressions de température, d’oxydation et d’osmose, respectivement (Fig. 6b-d). Dans les circonstances de base (c.-à-D., 30 °C, 0% d’H2O2 et 0 M de NaCl), il manque une différence de viabilité entre les levures KM et KM-100d. Cependant, en présence des différentes contraintes, les levures KM-100d présentent une viabilité nettement meilleure que celle des levures KM. De plus, les avantages sont plus importants tandis que les contraintes sont devenues plus graves (Fig. 6b-d). Nous nous attendions à ce que les tolérances aux contraintes multiples introduisent de nouvelles caractéristiques aux levures dans la production d’éthanol.

Nous avons étudié plus avant la productivité de l’éthanol entre les levures KM et KM-100d sous de multiples contraintes. Dans les circonstances de base (30 ° C et 0% d’éthanol, Fig. 6e), les levures KM et KM-100d sont presque les mêmes dans la consommation de glucose et la production d’éthanol. Cependant, les levures KM-100d ont montré des avantages significatifs en présence de température élevée (45 ° C, Fig. 6f) ou plus d’éthanol (6% ou 8%, Fig. 6g, h); l’environnement commun se produit généralement au stade tardif de la fermentation. Nous avons effectué une analyse RT-qPCR pour les levures KM et KM-100d fermentées en milieu avec de l’éthanol à 6% à 48 h, 72 h et 120 h (Fig. 7). La plupart de ces gènes tolérants à l’éthanol ont été régulés en KM-100d par rapport à en KM, en particulier au stade antérieur (48 h) pour un ajustement initial à l’éthanol (Fig. 7). En résumé, en régulant à la hausse les expressions des gènes tolérants à l’éthanol, les levures KM-100d ont surpassé les levures KM dans des environnements stressants avec des rendements en éthanol accrus.

Kluyveromyces marxianus développer une tolérance à l’éthanol au cours de l’évolution adaptative avec des améliorations significatives des voies multiples