Discussion
La production observée de niveaux élevés d’activité protéase pendant la culture continue de K. sedentarius a facilité la purification de deux protéases, P1 et P2, actives contre l’azocaséine, la chaîne β de l’insuline, la kératine extraite des cals humains et les cals non transformés. Les caractéristiques générales de ces enzymes, y compris la plage de substrat, la température et le pH optimaux et la sensibilité aux inhibiteurs de protéase, suggèrent qu’elles sont biochimiquement similaires et qu’elles appartiennent probablement à la famille des protéases à sérine alcaline. Ces protéases sont produites par une grande variété de microorganismes et agissent comme des endopeptidases (Rao et al. 1998).
La question de savoir si les enzymes peuvent également être classées comme kératinases reste cependant un sujet de débat. Les kératinases, par définition, devraient être capables d’hydrolyser la kératine native pure. L’extraction de la kératine, cependant, ne peut être obtenue que par un traitement préalable avec des agents dénaturants pour la séparer des protéines non kératiniques. Les traitements mécaniques tels que le broyage à billes entraînent le clivage des liaisons disulfures, ce qui rend la protéine plus sensible à la digestion protéolytique par des protéases telles que la trypsine et la protéinase K, qui ne sont pas classées comme kératinases (Noval et Nickerson, 1959). De même, l’utilisation de substrats stérilisés à la chaleur dans les dosages de kératinases a également été critiquée car le chauffage peut provoquer une dénaturation de la kératine.
Bien que dans la présente étude, des cals finement broyés aient été utilisés comme substrat enzymatique, le liquide surnageant de culture était actif contre des morceaux de cals intacts. Par conséquent, même si les deux protéases ne sont pas strictement des kératinases, elles dégradent les callosités humaines in vitro et il existe des preuves que cela se produit également in vivo (Nordstrom et al. 1987). Les protéases
ont également été classées comme kératinases en raison de leur activité sur la kératine réduite, auquel cas des agents réducteurs ont été soit ajoutés au mélange de dosage enzymatique, soit utilisés lors de l’extraction de la kératine. Bien que l’activité kératinolytique d’une gamme de bactéries cutanées ait été étudiée en utilisant la kératine « native » comme substrat, l’agent réducteur, le dithiothréitol (DTT), a été inclus dans le mélange de dosage. Par exemple, lorsque l’activité kératinase apparente de Staphylococcus epidermidis a été étudiée en l’absence de TNT, aucune activité n’a été détectée (Mikx et de Jong, 1987). De même, une protéase à sérine de Candida albicans a dégradé des kératines qui avaient été extraites de la couche cornée de semelles humaines avec de l’urée l−1 à 8 moles dans du Tris‐HCl et du β‐mercaptoéthanol (Hattori et al. 1984). Dans la présente étude, P1 et P2 ont hydrolysé de la kératine qui avait été extraite du cal du pied humain avec de l’urée et du β‐mercaptoéthanol mais, surtout, ont également pu dégrader le cal non traité.
La couche cornée et les cals humains sont une structure complexe et stable dont la kératine est un composant majeur. Il existe 30 gènes humains pour la kératine dont 18 sont exprimés sur la peau (Fuchs 1995). Un résumé de la base de données sur la kératine a montré que chaque kératine a des sites de clivage potentiels pour les protéases et Asp‐Arg et Gly‐Arg sont les plus courants. Si les filaments de kératine sont initialement cassés à ces endroits, il est possible que la dégradation progressive de ces unités plus petites se produise au niveau des sites de clivage secondaire, produisant une gamme de tailles de fragments peptidiques, comme le montre l’analyse de l’attaque protéase sur les kératines extraites des cals humains. Les résultats présentés à la Fig. 3b indiquent deux optima de pH pour l’activité de dégradation des cals de P2. Une explication possible est qu’il y a deux enzymes dans l’échantillon. Cela semble peu probable car l’échantillon d’enzyme utilisé a été hautement purifié, comme le montre la PAGE avec coloration à l’argent (voir fig. 1, voie 6). La possibilité de deux enzymes dégradant les cals dans l’échantillon P2 purifié avec des mobilités très similaires sur PAGE ne peut être exclue. Cependant, le même échantillon a été testé en utilisant les mêmes tampons avec le dosage de l’azocaséine et un seul optimum de pH a été détecté à pH 10 · 2. Une autre explication est que l’interaction complexe substrat de cals / enzyme à différents pH est un équilibre entre l’activité enzymatique et des changements conformationnels subtils du substrat, ce qui conduit à des optima de pH doubles.
Cette étude a montré que K. sedentarius produit deux protéases extracellulaires qui ont une activité de dégradation des cals. Des informations de base sur leurs tailles moléculaires relatives, leurs IP, ont été déterminées. Cependant, les études cinétiques enzymatiques classiques n’ont pas pu être abordées car le substrat naturel utilisé dans ces expériences in vitro était un mélange complexe de polymères, insolubles dans l’eau. L’activité enzymatique accrue de P2 en présence de sel 1-1 de 800 mmol peut être pertinente pour la survie du microorganisme sur la peau humaine, qui a une concentration de sel changeante en fonction de l’activité de la glande eccrine déterminée par le taux d’exercice de la personne et les températures environnementales. Le ou les mécanismes impliqués dans l’effet du chlorure de sodium n’ont pas été abordés. On suggère provisoirement que le chlorure de sodium peut affecter soit la structure tertiaire de l’enzyme et du substrat, soit les deux, pour améliorer l’accès du site actif des enzymes aux sites de clivage spécifiques du substrat.
L’explication la plus simple des résultats observés est que dans un surnageant de culture de K. sedentarius, il existe deux enzymes dégradant les cals, les sérine protéases, qui solubilisent également la kératine humaine présente dans les cals. Il est possible que K. sedentarius produit une protéase, codée par un gène, et cette activité autocatalytique ou autre protéase produit deux enzymes de poids moléculaires différents. Alternativement, il existe deux gènes codant deux enzymes indépendantes et étroitement liées. Cette dernière hypothèse est corroborée par une étude antérieure (Holland et al. 1992). Des échantillons de culture continue de K. sedentarius à l’état d’équilibre à différents taux de dilution, analysés sur PAGE et recouverts de caséine, ont montré deux enzymes, l’une constitutive et l’autre détectée à des concentrations élevées à des taux de dilution faibles. Fait important, à des taux de dilution proches de µmax, il n’a pas été détecté. La détermination de la séquence d’acides aminés N‐terminaux des polypeptides P1 (21 résidus) et P2 (15 résidus) a montré qu’ils étaient totalement différents. Ce résultat, combiné aux informations de l’expérience de culture continue, suggère que les enzymes sont codées indépendamment.
Les résultats de cette étude ont renforcé l’hypothèse selon laquelle des protéases spécifiques de K. sedentarius peuvent expliquer la dégradation des cals caractéristiques de la kératolyse dénoyautée. Les preuves à ce jour suggèrent également que deux protéases sont impliquées et qu’elles sont actives au pH du site cutané, le pH 6·3-6·9 (Marshall et coll. 1988). L’interprétation des résultats obtenus à partir d’expériences in vitro dans l’environnement in vivo peut être remise en question, même si le cal humain a été utilisé comme substrat. Idéalement, des biopsies de peau humaine doivent être effectuées, y compris les zones de peau normale et dénoyautée. La présence et la localisation ou l’absence des protéases peuvent ensuite être déterminées par des techniques histologiques utilisant des anticorps monoclonaux comme sondes pour les protéases et K. sedentarius. Cependant, l’approbation éthique ne serait pas donnée pour les biopsies à partir de l’emplacement requis, le site porteur du pied, d’un nombre représentatif de personnes. L’implication de K. sedentarius dans la kératytose dénoyautée par un mécanisme de production de protéases dégradant la kératine n’a pas été formellement prouvée. Cependant, il n’y a aucune preuve réfutant les hypothèses et sa crédibilité a été renforcée par les résultats présentés ici. Des preuves solides in vitro ont été présentées impliquant K. sedentarius et ses enzymes de dégradation des cals extracellulaires dans la kératolyse dénoyautée. À un pH cutané normal et à une hydratation de surface, la production et l’activité de ces enzymes seront faibles, P1 étant la plus active. Dans des conditions environnementales d’occlusion et sur une hygeine pauvre, le pH de la peau se déplace vers et légèrement au-dessus de la neutralité. Ces conditions favorisent P2. Les deux enzymes sont très probablement des enzymes de balayage, permettant à K. sedentarius d’obtenir des sources de carbone et d’azote, de petits peptides, enfermés dans le polymère complexe résident et insoluble, la kératine. À l’heure actuelle, la régulation de la production de ces enzymes est inconnue, de même que leur contribution relative à la dégradation des cals in vivo. En plus des implications cliniques, les protéases kératinolytiques ont une valeur considérable pour le secteur commercial car elles sont utiles dans un certain nombre de processus industriels, y compris la dégradation des déchets de kératine des industries de la volaille et du cuir (Shih 1993; Onifade et al. 1998). L’activité kératinolytique élevée du K. les protéases sedentarius à des températures et un pH relativement bas, comparées à de nombreuses autres protéases, présentent une application potentielle de ces enzymes dans l’industrie biotechnologique.
