Le facteur 2 de type Kruppel (KLF2) régule l’activation pro-inflammatoire des monocytes

Résultats

L’expression de KLF2 Est réduite avec l’Activation / Différenciation des monocytes en Macrophages.

Pour mieux comprendre le rôle de KLF2 dans la régulation des cellules immunitaires telles que les monocytes/macrophages, nous avons d’abord évalué l’expression de KLF2 dans les monocytes humains primaires. Comme le montre la Fig. 1 A Gauche, l’expression de KLF2 est robuste dans les monocytes humains primaires et fortement réduite avec différenciation en macrophages après 5 jours. L’expression de KLF2 dans la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 était beaucoup plus faible que celle des monocytes humains primaires. Cependant, l’expression a encore été réduite lors du traitement de ces cellules avec du LPS ou du 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate, deux agents bien établis pour induire l’activation ou la différenciation cellulaire (Fig. 1 A à Droite).

Nous avons ensuite cherché à déterminer si l’expression de KLF2 est régulée dans le cadre inflammatoire in vivo. L’activation monocytaire est un événement physiopathologique clé dans le développement de l’athérosclérose, une maladie inflammatoire chronique de bas grade, nous avons donc estimé que l’expression de KLF2 pouvait être réduite chez ces patients (11). Nous avons examiné un groupe de 14 sujets normaux appariés à l’âge et de 14 patients atteints d’athérosclérose étendue (≈50% avec des antécédents de revascularisation de l’artère coronaire) qui sont stratifiés par les niveaux les plus bas et les plus élevés du gène de l’ostéosarcome de Finkel-Biskis–Jinkins (FOS), respectivement, qui sert de marqueur de l’inflammation (12). Comme le montre la Fig. 1 B, l’expression de KLF2 a été significativement réduite de ≈30% chez les patients. En revanche, aucun effet significatif n’a été observé pour KLF3, KLF6, KLF11 et KLF13. Conformément à notre étude précédente, l’expression du FOS a été significativement augmentée chez les patients atteints de maladie coronarienne (12).

KLF2 Inhibe l’Activation des Monocytes et la Capacité Phagocytaire.

En réponse à des stimuli inflammatoires, les monocytes expriment des niveaux accrus de facteurs pro-inflammatoires et de cytokines / chimiokines et présentent une capacité phagocytaire accrue. Pour mieux comprendre le rôle de KLF2 dans la fonction des monocytes, nous avons entrepris des études sur la surexpression. Les cellules THP-1 ont été infectées par le virus vide témoin (EV) ou le KLF2 (Ad-KLF2) pendant 24 à 48 h, puis stimulées par le LPS pendant 2 et 6 h. Comme le montre la Fig. 2 A, le traitement de cellules infectées par EV avec du LPS (25 ng / ml) a entraîné une induction robuste de la cyclooxygénase (COX)-2, du facteur tissulaire et de la protéine chimioattractante monocytaire (MCP)-1 ARNm. En revanche, cette induction a été nettement atténuée dans les cellules infectées par KLF2 (Fig. 2 Bis). Des effets similaires ont également été observés dans la lignée monocytaire de souris J774a (données non présentées). De plus, la surexpression de KLF2 inhibe fortement la sécrétion de diverses cytokines et chimiokines. Comme le montre la Fig. La surexpression de 2 B, KLF2 a atténué l’induction médiée par le LPS de facteurs tels que CD40L (de 49,6%), la protéine inflammatoire macrophage 1α (48,4%), la protéine inflammatoire macrophage 1β (64,2%), l’IL-1β (55,0%), l’IL-8 (79,1%), le TNF-α (50,2%) et le MCP-1 (68,8%). Cet effet était spécifique car aucun effet significatif n’a été observé sur les niveaux de plusieurs autres facteurs de croissance pertinents (TGFß1, facteur de croissance dérivé des plaquettes et facteur stimulant les colonies de granulocytes/macrophages), de cytokines/chimiokines (IL-4, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-1α et IFN-γ) ou d’enzymes altérant la matrice (métalloprotéinases matricielles de types 1, 2, 3 et 9) (données non présentées).

Une caractéristique classique du monocyte / macrophage activé est la phagocytose. Pour déterminer si la surexpression de KLF2 affecte la capacité phagocytaire des monocytes, nous avons surexprimé KLF2 ou témoin (EV) dans des cellules THP-1, stimulé avec du LPS, et évalué la capacité de ces cellules à prendre des bioparticules de zymosan A marquées au rouge du Texas. Comme le montre la Fig. 2 C, les cellules infectées par le virus de contrôle ont ingéré les bioparticules de zymosan. En revanche, l’absorption par les monocytes exprimant KLF2 a été nettement réduite (Fig. 2 C). Prises ensemble, ces données démontrent que KLF2 peut inhiber la sécrétion monocytaire de cytokines / chimiokines et la phagocytose.

KLF2 N’Inhibe Pas Le Recrutement Des Monocytes.

Nous avons ensuite cherché à évaluer l’effet de KLF2 sur la fonction monocytaire in vivo. En réponse à une blessure ou à un stimulus inflammatoire, les monocytes sont recrutés dans la circulation sanguine vers les tissus. Nous avons d’abord entrepris des études pour évaluer si le recrutement de monocytes était modifié par l’expression de KLF2. Pour minimiser la contribution d’autres types de cellules, nous avons utilisé des souris C.B-17-Scid-beige déficientes en cellules T, B et tueuses naturelles. Ces animaux (n = 5 par groupe) ont ensuite été soumis à une irradiation corporelle totale et reconstitués avec des cellules J774a infectées adénoviralement par le virus témoin (EV) ou le KLF2 au moyen d’une injection de veine de queue (décrite dans Matériaux et méthodes). Les animaux ont ensuite été soumis à une injection i.p. de thioglycolate (un puissant irritant chimique qui induit le recrutement de monocytes), et le nombre de cellules GFP positives a été évalué 48 h plus tard par analyse cytométrique en flux. Comme le montre la Fig. 2 C et D, KLF2 n’a pas inhibé le recrutement des monocytes GFP + J774a dans la cavité péritonéale. En effet, nous avons observé de manière reproductible que les animaux transduits par KLF2 présentaient une augmentation significative des cellules GFP+. Ces données suggèrent que KLF2 n’inhibe pas mais augmente plutôt le recrutement monocytaire vers un site inflammatoire.

KLF2 Inhibe L’Inflammation Induite Par La Carraghénane.

Après le recrutement et la migration dans les tissus, les monocytes sécrètent des cytokines, des chimiokines et des facteurs de croissance pour perpétuer la réponse inflammatoire. Comme le montre la Fig. 2b, nous avons noté que la surexpression de KLF2 atténuait l’élaboration de plusieurs cytokines et chimiokines. Pour déterminer si KLF2 affecte la fonction pro-inflammatoire monocytaire, nous avons utilisé un modèle bien établi pour l’inflammation: l’injection de coussinet plantaire induite par le carraghénane. Il a été démontré précédemment que l’injection de ce produit chimique induisait de manière reproductible une réponse inflammatoire caractérisée par un œdème de la patte (13-15). Des souris C.B-17-Scid-beige (n = 4 par groupe) ont été irradiées comme décrit ci-dessus, reconstituées avec des cellules J774a témoins ou exprimant le KLF2, puis soumises à une injection de carraghénane dans le coussinet plantaire (décrit dans Matériaux et méthodes). Le volume de la patte a été déterminé à l’aide d’un hydropléthismomètre modifié pour de petits volumes (Ugo Basile, Milan). Comme le montre la Fig. 2 F, les animaux infectés par EV ont présenté une augmentation du volume de la patte de 17 ± 1,08 mm3 et de 23,3 ± 3,05 mm3 après 1 et 2 h d’injection de carraghénane, respectivement. En revanche, les animaux reconstitués avec des cellules J774a exprimant KLF2 n’ont montré qu’une augmentation du volume de la patte de 6,25 ± 0,85 mm3 et de 7,5 ± 0,95 mm3 respectivement 1 et 2 h après l’injection de carraghénane (Fig. 2 F). Conformément à cet effet brut, l’analyse histologique des pattes a révélé une extravasation liquide réduite, ce qui conduit à la formation d’un œdème (Fig. 2 G, flèches).

Effet du Knockdown KLF2 sur l’expression des gènes inflammatoires.

Pour déterminer l’importance de KLF2 dans l’expression des gènes inflammatoires monocytaires, des études de knockdown médiées par de petits ARN interférents (ARNSI) ont également été entreprises. Comme le montre la Fig. 2 H, en comparaison avec les cellules non traitées (témoins) et non spécifiques traitées par siRNA, le knockdown de KLF2 (≈60% de knockdown) dans les cellules J774a a entraîné une induction de gènes inflammatoires tels que MCP-1 et un effet plus modeste sur les niveaux d’expression de la COX-2 et du facteur tissulaire. Ces résultats ont également été vérifiés avec une analyse PCR en temps réel (Fig. 2 I).

KLF2 Inhibe les activités des promoteurs NF-kB et AP-1.

KLF2 peut inhiber de manière puissante l’induction médiée par le LPS du MCP-1, de la COX-2 et du facteur tissulaire (Fig. 2 Bis). L’induction de ces cibles par des stimuli pro-inflammatoires est connue pour être régulée par des voies transcriptionnelles telles que NF-kB et AP-1. Nous avons estimé qu’en principe, KLF2 peut inhiber ces voies à plusieurs niveaux tels que l’expression, la liaison à l’ADN ou l’induction de l’activité transcriptionnelle.

Nous nous sommes d’abord concentrés sur le NF-kB compte tenu de son rôle central dans l’inflammation. La surexpression de KLF2 n’a pas modifié l’accumulation nucléaire de p65 ni les niveaux nucléaires de kinase IkB (IKK) α et IKKy (Fig. 3 Bis). De plus, la surexpression de KLF2 n’a pas modifié la cinétique de la phosphorylation ou de la dégradation d’IkB ni les niveaux cytoplasmiques d’IKKa, d’IKKß et d’IKKy (Fig. 3 B). Conformément à ces observations, KLF2 n’a pas affecté la liaison de NF-kB à l’ADN. Comme le montre la Fig. 3 C, le traitement des cellules infectées par le virus témoin (EV) avec du LPS induit une seule bande majeure. Des études de compétition et de supershift ont vérifié que cette bande représente NF-κΒ. Un schéma presque identique de liaison NF-kB a été observé dans les cellules surexprimant KLF2. Pour évaluer si KLF2 peut affecter l’activation transcriptionnelle médiée par NF-kB, des dosages de rapporteurs de gènes ont été entrepris. Comme le montre la Fig. 3D, transfection de p65 avec un plasmide rapporteur de luciférase NF-kB induit une activité transcriptionnelle par ≈11 fois. Cette induction a été fortement réduite en présence de KLF2, indiquant que KLF2 inhibe l’activité transcriptionnelle de NF-kB. Des effets similaires de KLF2 ont été observés pour la voie AP-1 (Fig. 5 A-C, qui est publié à l’appui sur le site Web du PNAS).

Recrutement du Facteur Associé au Coactivateur CBP (PCAF) par KLF2 comme Mécanisme Unificateur.

Pris ensemble, les résultats de la Fig. 3 indiquent que KLF2 peut inhiber la transactivation médiée par NF-kB indépendamment des effets sur la liaison de l’ADN de ces facteurs. Un mécanisme possible est le recrutement de coactivateurs critiques. Par exemple, la liaison optimale NF-kB nécessite une interaction avec plusieurs coactivateurs clés tels que le coactivateur des récepteurs stéroïdiens (SRC) -1, le PCAF et le p300 / CBP. KLF2 peut interagir avec un ou plusieurs de ces facteurs, les éloigner de NF-kB et, par conséquent, réduire l’activité transcriptionnelle médiée par NF-kB.

Pour déterminer le rôle du PCAF dans l’inhibition médiée par KLF2 de l’activité transcriptionnelle de NF-kB, nous avons effectué des études de cotransfection avec du PCAF exogène. Transfection de PCAF (mais pas de p300; données non représentées) ont sauvé de manière significative la répression médiée par KLF2 du concatème NF-kB (Fig. 4 Bis). Un sauvetage partiel a également été observé sur la capacité de KLF2 à inhiber l’activité transcriptionnelle d’AP-1 (Fig. 5D). Pour déterminer si KLF2 et PCAF interagissent l’un avec l’autre, nous avons effectué des tests de traction vers le bas et de coimmunoprécipitation de la TPS. En utilisant des produits transcrits et traduits in vitro, nous avons constaté que KLF2 et PCAF peuvent interagir directement dans un système sans cellules (Fig. 4 B). Pour savoir si le PCAF se lie au KLF2 in vivo, nous avons surexprimé le KLF2 (marqué à l’hémagglutinine) et le PCAF (marqué à l’indicateur) dans des cellules COS-7. Une immunoprécipitation avec un anticorps anti-Flag suivie d’un Western blot avec un anticorps anti-hémagglutinine a montré que KLF2 se lie au PCAF dans les cellules (Fig. 4 C).

Pour déterminer si les mécanismes sous-jacents aux effets observés sont opérationnels in vivo, nous avons entrepris des études d’immunoprécipitation à la chromatine (ChIP). Comme prévu, la stimulation LPS des cellules THP-1 a conduit au recrutement de p65 et de PCAF sur le promoteur COX-2 (Fig. 4 D). De plus, une acétylation concomitante de HH3 et de HH4 a été observée. Cependant, dans le contexte de la surexpression de KLF2, le recrutement de PCAF et l’acétylation des histones sont tous deux fortement atténués (Fig. 4 D). Conformément à nos tests de gel-shift, aucun effet significatif de KLF2 n’a été observé sur le recrutement de p65.