Poisson zèbre entretien et stocks : Les poissons zèbres (Danio rerio) ont été élevés et mis en scène selon les protocoles établis30.Les lignées transgéniques utilisées étaient Tg (kdr-l: ras-mCherry) s91631, Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf49532, Tg (fli1: myr-EGFP) ncv233, Tg (fli1: myr-mCherry) ncv134, Tg (fli1: Lifeact-mCherry) ncv733, Tg (fli1: GAL4FF) ubs37, Tg (SAMU:EGFP-UCHD) ubs1835, TgBAC (pdgfrb: GFP) ncv2236 et Tg (kdrl: EGFP) s84337. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité Institutionnel des Soins et de l’utilisation des animaux de la succursale de RIKEN Kobe (IACUC).
Plasmides et oligonucléotides : Les poissons zèbres marcksl1a, marcksl1b et fscn1a ont été clonés par PCR à partir d’ADNc d’embryons de 1 dpf à l’aide du kit de clonage PCR NEB®. Toutes les constructions d’expression utilisées dans cette étude ont été générées via le clonage Gateway® et/ou le clonage In-Fusion® à l’aide de plasmides de Tol2Kit38. Des plasmides avec Marcksl1a et Marcksl1b mutés ont été générés à l’aide du kit de mutagenèse dirigée sur site (NEB) Q5®. Des vecteurs contenant des shRNA ont été construits par ligation de la séquence des shRNA entre les sites EcoRI et PmeI en aval du promoteur U6 du vecteur pEGFP-U6 modifié 39 (un don de Zuoshang Xu, plasmide Addgène #19799). La séquence cible pour le MARCKSL1 humain est de 5′-GTGTGAACGGAACAGATGATG-3′. La séquence de shRNA brouillée 5′ – GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3′ a été conçue comme une séquence non assortie (soulignée) de MARCKSL1 shRNA. Les vecteurs contenant des souris Marcksl1, Marcksl1-S120A / T148A / T183A (Marcksl1-AAA) et Marcksl1-S120D / T148D / T183D (Marcksl1-DDD) sous-clonés en pEGFP-N1 (Clontech) 10 étaient des cadeaux d’Eleanor T. Coffey (Université de Turku). Des informations détaillées concernant les plasmides et les amorces utilisées dans cette étude se trouvent dans les tableaux supplémentaires 1 et 2, respectivement.
Isolement d’ARN et synthèse d’ADNc: L’ARN total a été isolé à l’aide du Réactif TRI (Épigénétique) et du kit de MicroPrep d’ARN Direct-zolTM (Zymo Research) et l’ADNc a été synthétisé à l’aide du système de synthèse du premier brin Exposant III® (Invitrogen) selon les protocoles du fabricant.
Expression en mosaïque de constructions et de lignées de poissons zèbres transgéniques: Des constructions d’expression basées sur Tol2 (5-10 pg) ont été co-injectées dans des embryons de poisson-zèbre à un stade cellulaire avec 50 pg d’ARNm de transposase Tol2 transcrit à partir du vecteur pCS-TP NON-linéarisé (un cadeau de Koichi Kawakami, Institut national de génétique, Japon) en utilisant le kit mMESSAGE mMACHINE SP6 (Invitrogen). Pour l’expression en mosaïque des transgènes, les embryons ont été analysés à 1 ou 2 dpf après les injections. Pour générer des lignées Tg (fli1ep: myl9b-EGFP) rk25 et Tg (fli1ep: EGFP-PLC1δPH) rk26, des embryons injectés ont été élevés à des adultes et dépistés pour les fondateurs.
Génération des mutants marcksl1a et marcksl1b du poisson zèbre : les mutants marcksl1a ont été générés par mutagenèse médiée par CRISPR/Cas9. Un ARN à guide unique (ARNSGR) ciblant le deuxième exon (Fig. supplémentaire. 4a) a été générée en utilisant un protocole indépendant du clonage 40. Le complexe RNP Cas9/sgRNA a été assemblé juste avant l’injection et après 5 min d’incubation à température ambiante, 200 pg de protéine Cas9 (Invitrogen) et 100 pg de sgRNA ont été co-injectés dans un embryon de stade unicellulaire Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495; Tg (kdr-l: ras-mCherry) s916. les mutants marcksl1b ont été générés par mutagenèse médiée par TALEN. TALEN ciblant le premier exon de marcksl1b (fig. supplémentaire. 4b) a été conçu à l’aide du TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 (https:// tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old ) et ont été assemblés par la méthode du Golden Gate 41. Les di-résidus variables à répétition TALEN (RVD) ont été clonés dans un vecteur RCIscript-GoldyTALEN (Addgene) et les ARNM plafonnés pour chaque TALENs ont été transcrits in vitro à partir de plasmides d’expression SACI-linéarisés à l’aide du kit mMESSAGE mMACHINE T3 (Invitrogen). Étape à une cellule Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495; Tg (kdr-l:des embryons ras-mCherry) s916 ont été microinjectés avec 200 pg d’ARN (100 pg de chaque ARNM TALEN gauche et droit). Les fondateurs de F0 ont été identifiés en croisant des poissons injectés par TALEN ou CRISPR/Cas9 avec des poissons de type sauvage et en examinant la progéniture pour détecter des mutations à 2 dpf à l’aide du dosage de l’endonucléase I (NEB) T7 (pour les poissons injectés par TALEN) ou du séquençage de Sanger (pour les poissons injectés par CRISPR /Cas9). En bref, l’ADN génomique a été isolé de groupes de cinq embryons à l’aide de la méthode HotSHOT 42 et les régions génomiques correspondantes ont été amplifiées. Les mutations ont été évaluées par séquençage direct de produits PCR purifiés. Des descendants F1 de F0 positifs ont été élevés à l’âge adulte et des porteurs hétérozygotes de mutations ont été identifiés par découpage des nageoires et analyse PCR de génotypage de routine utilisant les mêmes amorces.
Six allèles mutants de marcksl1a et cinq allèles mutants de marcksl1b ont été identifiés lors du dépistage (fig. 13). L’allèle rk23 présente une délétion 2-nt qui conduit à un décalage de cadre après l’acide aminé 51 et à un codon d’arrêt prématuré à l’acide aminé 56 après 5 acides aminés faux sens (Fig. supplémentaire. 4 bis, c). L’allèle rk24 présente une délétion 5-nt qui conduit à un décalage de cadre après l’acide aminé 13 et à un codon d’arrêt prématuré à l’acide aminé 17 après 4 acides aminés faux sens (Fig. supplémentaire. 4b, d). Pour ces raisons, nous considérons marcksl1ark23 et marcksl1brk24 comme des allèles nuls et nous avons concentré nos recherches sur les analyses de ces mutants.
Imagerie vivante : Des embryons ont été montés dans 0,8% d’agarose à faible fusion (Bio-Rad) en milieu E3 contenant 0,16 mg/mL de tricaïne et 0,003% de phénylthiourée. Les piles z confocales ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif Olympus IX83/ Yokogawa CSU-W1 inversé équipé d’une caméra CMOS Zyla 4.2 (Andor). Des images en champ lumineux ont été acquises au microscope Leica M205FA. Les images ont été traitées à l’aide de Fidji (NIH).
Ablation laser: Les ablations laser ont été réalisées à l’aide d’un laser de 405 nm (Andor) et d’un module FRAPPA (Andor) montés sur un microscope confocal Olympus IX83/ Yokogawa CSU-W1 inversé avec un objectif à immersion dans l’eau Olympus UPLSAPO 60x/NA 1.2. Trois ablations laser séquentielles avec un temps de séjour de 1000 µs chacune ont été appliquées à une puissance laser de 51%.
Microangiographie : Une microangiographie a été réalisée sur des embryons de type sauvage, marcksl1ark23, marcksl1brk24 et marcksl1ark23; marcksl1brk24. Au total, 2 et 3 embryons de FAP ont été injectés avec 1-2 nL dextrane tétraméthyl rhodamine ou dextrane fluorescéine (MW = 2000 kDa, Invitrogène) à 10 mg/mL et immédiatement imagés. Les piles z confocales ont été acquises avec un objectif Olympus UPLSAPO 10×/NA 0,4. Pour couvrir l’embryon entier, plusieurs régions ont été imagées et cousues à l’aide du plugin de couture dans Fiji43.
Transplantation de cellules: Des groupes de 15 à 25 cellules donneuses provenant d’embryons mutants marcksl1ark23; marcksl1brk24 dans le contexte Tg (kdr-l: ras-mCherry) s916 ont été collectés à partir d’une position aléatoire dans le blastoderme et transplantés dans la zone marginale latérale du blastoderme 44 d’embryons receveurs de type sauvage à 4,5–6 hpf. L’extraction et la transplantation ont été effectuées à l’aide d’un micro-injecteur d’huile CellTram® 4r (Eppendorf) avec un capillaire en verre borosilicaté GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) fabriqué avec un extracteur de micropipette horizontal P-87 (Sutter Instrument Co.) et une microforge MF-900 (Narishige) pour obtenir une pointe lisse en forme de cuillère. Au cours de la transplantation, les embryons ont été conservés dans des boîtes de pétri enrobées d’agarose avec un tampon 0,5 x E2. À 2 dpf, des embryons avec des ISV positifs à mCherry ont été sélectionnés pour la microangiographie et l’imagerie. Au total, huit transplantations indépendantes ont été effectuées.
Traitements chimiques : Latrunculine B (Merck Millipore) est dissoute dans du DMSO à 1 mg/ml et stockée à -20 °C. CK666 (SIGMA) est dissoute dans du DMSO à 50 mM et stockée à 4 °C. Tous les composés sont dilués à la concentration désirée dans du Tampon E3.
Expérience de transfection, de knockdown protéique médié par le siRNA et de stress de cisaillement: Les HUVECs (Lonza, C-2519A) ont été cultivés en milieu EGM (Lonza) et utilisés jusqu’au passage 4. Pour les transfections de plasmides, des cellules ont été ensemencées en milieu Opti-MEM (Gibco) à 5,8 × 104 cellules/cm2 sur des lamelles de poly-l-Lysine et enrobées de gélatine et transfectées avec 2 µg de plasmide à l’aide de Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific). Deux heures après la transfection, le milieu Opti-MEM a été changé en milieu EGM sans antibiotiques. Pour la transfection d’ARNsi, HUVECs (7.9 × 104 cellules/cm2) ont été transfectées avec un ARNsi de 20 nM à l’aide du réactif DharmaFECT1 (Dharmacon). La transfection a été répétée après 24 h. Les cellules ont été cultivées pendant 24 h supplémentaires avant l’extraction ou la fixation totale de l’ARN. ON-TARGETplus human MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) a été utilisé pour renverser MARCKSL1. Le pool non cible ON-TARGETplus (Dharmacon) a été utilisé comme transfection d’ARNsi de contrôle. Les cellules ont été fixées avec 4% de PFA / PBS, perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 et colorées avec du DAPI de 14 µM pour le marquage des noyaux, Alexa 568-phalloïdine (1:1000, ThermoFisher Scientific) pour la visualisation de l’actine F et de l’anticorps anti-VE-cadhérine (1: 100, Signalisation cellulaire) suivi de l’anticorps secondaire anti-lapin Alexa 488 (1: 1000, ThermoFisher Scientific) pour marquer les jonctions EC.
Pour les expériences de contrainte de cisaillement, des HPAEC (Lonza) ont été cultivées à 1000-1500 cellules/mm2 sur un plat enrobé de gélatine à 1% en milieu EGM-2 (Lonza) et utilisées avant le passage 9. Les cellules ont été exposées à une contrainte de cisaillement statique ou laminaire à 15 dyn/cm2 pendant 0,5,1 ou 6 h à l’aide d’un appareil de type plaque parallèle45,46. Un côté de la chambre d’écoulement était constitué d’une plaque de verre recouverte de gélatine à 1% sur laquelle reposaient les HPAEC cultivés, et l’autre côté était constitué d’une plaque de polycarbonate. Leurs surfaces planes ont été maintenues espacées de 200 µm avec un joint en téflon. La chambre était munie d’une entrée et d’une sortie pour le fluide, et l’entrée était reliée à un réservoir supérieur avec un tube en silicone. La sortie était ouverte sur un réservoir inférieur. Le débit était entraîné par une pompe à rouleaux / tubes. Le fluide (milieu EGM-2) est passé du réservoir supérieur à travers la chambre d’écoulement dans le réservoir inférieur. Le débit a été contrôlé avec un débitmètre à ultrasons (HT107, Systèmes Transsoniques) placé à l’entrée, et il a été contrôlé en modifiant la différence de hauteur entre le réservoir supérieur et la sortie de la chambre d’écoulement. L’intensité de la contrainte de cisaillement (τ, dynes / cm2) agissant sur la couche CE a été calculée en utilisant la formule τ = 6µQ / a2b, où μ est la viscosité du perfusat (poise), Q est le volume d’écoulement (ml /s), et a et b sont les dimensions en coupe transversale du trajet d’écoulement (cm). Après exposition au stress de cisaillement, l’ARN total a été isolé pour qPCR.
PCR quantitative en temps réel : La qPCR a été réalisée en utilisant 1 µL d’ADNc, généré à partir de 150 ng (HPAEC) ou 500 ng (HUVEC) d’ARN total, dans un mélange réactionnel de 10 µL contenant 1X Luna Universal qPCR Master Mix (NEB) et des amorces avant et arrière de 400 nM. Les réactions ont été exécutées sur l’instrument ABI Prism 7900HT en quadruple exemplaire. Les données ont été analysées à l’aide du logiciel RQ Manager (Applied Biosystems) et l’expression relative de l’ARNm de MARCKSL1 a été calculée avec la méthode 2−δδct47 en utilisant GAPDH comme gène de référence.
Hybridation in situ de monture entière: L’hybridation in situ de montures entières a été réalisée selon le protocole normal48. Les embryons ont été fixés dans 4% de PFA à 24, 48 et 72 hpf et perméabilisés avec 10 µg/mL de protéinase K. L’hybridation a été réalisée dans un tampon contenant 5% de sulfate de dextrane de sodium (MW = 500 kDa) à 70 °C pendant une nuit. Après lavage de stringence, les échantillons ont été bloqués avec du réactif bloquant à 2% (Roche) dans du tampon d’acide maléique et incubés pendant une nuit avec un anticorps anti-digoxigénine (DIG) conjugué à la phosphatase alcaline (Roche, 1: 5000) à 4 ° C. Les embryons ont été colorés avec une solution de NBT/ BCIP (Roche) dans du tampon de coloration. Les embryons ont été nettoyés dans du glycérol à 70% pendant la nuit et imagés au microscope Leica M205FA. Les ribosondes de 1,2 kb marquées marcksl1a et marcksl1b ont été générées à partir de plasmides codant les ADNC sur toute la longueur à l’aide de kits MEGAscript SP6 ou T7 (Invitrogen).
Séquençage d’ARN unicellulaire : Les ECS ont été isolés à partir d’embryons transgéniques Tg (kdrl: EGFP) s843. Le tri des cellules a été effectué avec le trieur de cellules FACSAriaII (BD Bioscience). Une suspension unicellulaire a été chargée dans le système Chromium 10X et des bibliothèques d’ADNc ont été construites en utilisant le kit GEMME, Bibliothèque et Perle de gel v2 de Chromium Next GEM Single Cell 3′ (Génomique 10X) selon le protocole du fabricant. La bibliothèque a été séquencée sur le séquenceur Illumina HiSeq 1500 (Illumina, États-Unis). Cell Ranger v2.1 a été utilisé pour dé-multiplexer les fichiers d’appel de base brut (BCL) générés par les séquenceurs Illumina en fichiers FASTQ, effectuer l’alignement, le comptage de codes à barres et le comptage UMI. Les lectures de séquençage ont été cartographiées sur l’assemblage du génome du poisson zèbre (GRCz11, Ensembl release 92). D’autres analyses ont été effectuées à l’aide du package49 de Seurat dans le logiciel R (https://www.r-project.org). Les matrices d’expression ont d’abord été filtrées en conservant des gènes qui sont exprimés dans un minimum de 3 cellules et des cellules qui ont exprimé un minimum de 200 gènes pour une analyse en aval. Les cellules ont ensuite été filtrées en sélectionnant des cellules exprimant un faible contenu mitochondrial (< 7%). Les données ont ensuite été normalisées à l’aide de la fonction NormalizedData qui normalise l’expression génique de chaque cellule par l’expression totale.
Quantification du diamètre des vaisseaux sanguins: Tg vivant (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495; Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 des embryons sauvages transgéniques ou mutants marcksl1 ont été imagés à 50-52 hpf. Les piles z confocales ont été acquises avec un objectif à immersion dans l’huile de silicone Olympus UPLSAPO 40×/NA1.25. Pour les calculs de diamètre DA et PCV, 4 à 5 mesures ont été effectuées entre les ISV le long de l’extension du jaune (ISV n° 10-14). Pour le diamètre de l’ISV, une moyenne de 6 mesures a été effectuée le long de chaque ISV (ISV n° 10-14) entre le DA et le DLAV. Les mesures ont été effectuées à l’aide de Fidji (NIH).
Quantification du nombre CE et de la prolifération: Pour compter le numéro CE, 52 embryons de type sauvage hpf, marcksl1ark23, marcksl1brk24 ou marcksl1ark23; des embryons de marcksl1brk24 en fond Tg (kdr-l: ras-mCherry) s916 ont été fixés dans du PFA à 4% et colorés avec du DAPI de 3 µM. Les piles z confocales ont été acquises avec un objectif à immersion dans l’huile de silicone Olympus UPLSAPO 40x/NA 1,25. Les noyaux ont été comptés dans chaque ISV (ISV n° 9-22) entre le DA et le DLAV. Pour quantifier les ECs mitotiques dans les ISV, les types sauvages ou les marcksl1ark23; les embryons de marcksl1brk24 dans Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495; Tg (kdr-l:le fond ras-mCherry) s916 a été fixé dans 4% de PFA à 30, 36 et 48 hpf, perméabilisé dans 1% de DMSO / 1% de Triton X-100 et coloré avec un anticorps anti-phospho H3 (1:250, Merck Millipore) suivi d’un anticorps secondaire anti-rabbit Alexa 488 (1:1000, ThermoFisher Scientific) et 3 µM de DAPI. Les piles z confocales ont été acquises avec un objectif à immersion dans l’huile de silicone Olympus UPLSAPO 40x/NA 1,25. Les cellules mitotiques (cellules positives au pH3) ont été comptées dans les ISV des deux côtés de l’embryon (ISV n° 9-22). Les ISV ont été visualisés à l’aide de la fluorescence mCherry. Une seule cellule pH3 positive par ISV a été détectée quelle que soit la position de l’ISV. Pendant le comptage, nous avons considéré EC dans la télophase comme une seule cellule. Pour compter le nombre de divisions EC, les embryons de type sauvage ou marcksl1ark23; marcksl1brk24 dans le fond Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495; Tg (kdr-l: ras-mCherry) s916 ont été imagés de 24 à 48 hpf à intervalles de 6 minutes à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile de silicone Olympus UPLSAPO 30×/NA 1,05. Le nombre de divisions cellulaires dans chaque ISV (ISV n° 11-15) a été quantifié.
Quantification des taux d’actomyosine dans le cortex apical : Tg vivant (fli1: Lifeact-mCherry) ncv7; Les embryons de poissons zèbres Tg(fli1ep: EGFP-PLCδ1PH) rk26 et Tg (fli1ep: myl9b-EGFP) rk25; Tg (kdr-l: ras-mCherry) s916 ont été imagés à 30-34 hpf à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau Olympus UPLSAPO 60×/NA 1.2. L’intensité de Lifeact ou Myl9b le long du cortex apical et dans le cytoplasme a été mesurée à l’aide de Fiji. Le rapport entre l’intensité moyenne corticale et l’intensité cytoplasmique a été calculé.
Analyse in vivo de la forme des cellules : Le marquage unicellulaire des ECS dans les ISV a été réalisé par expression en mosaïque d’embryons mutants de type sauvage, marcksl1brk24 ou marcksl1ark23, marcksl1brk24 ou fli1ep:plasmide marcksl1b-EGFP dans des embryons de type sauvage. À 2 dpf, une microangiographie a été réalisée et les vaisseaux ont été imagés avec un objectif à immersion dans l’eau Olympus UPLSAPO 60 ×/ NA 1,2 avec un intervalle de plans Z optiques de 0,25 µm. L’analyse de la forme des cellules des ECS des ISV a été réalisée de manière semi-automatisée à l’aide d’un script ImageJ écrit sur mesure développé en Python, étendant la méthode décrite dans ref. 50. Les images ont d’abord été grossièrement recadrées pour réduire les besoins en mémoire en aval et des métadonnées supplémentaires (type de navire et identifiant d’embryon) ont été remplies. Un script séparé a ensuite été exécuté pour projeter et déballer des cellules autour d’un vaisseau sur une surface 2D. Brièvement, les images recadrées ont d’abord été tournées en fonction du type de récipient pour aligner grossièrement l’axe du récipient avec la direction Z dans une pile d’images, et le canal de l’étiquette de cellule de mosaïque fluorescente a été sélectionné pour la projection. Pour résoudre les problèmes de segmentation automatisée des vaisseaux dans le canal de fluorescence du pool sanguin causés par des structures de fond fluorescentes variables et une perfusion de dextran-rhodamine hors du vaisseau, l’axe du vaisseau a été identifié en définissant manuellement la position du vaisseau environ tous les 10 µm à travers la pile d’images, puis en effectuant un ajustement et une interpolation de spline Catmull-Rom. Les données ont ensuite été transformées afin de redresser l’axe du navire en trois dimensions. Ensuite, la position de l’intensité maximale dans le canal de projection a été identifiée le long des rayons à des intervalles de 1 ° autour de l’axe du vaisseau. Ces informations ont été utilisées pour projeter l’intensité de fluorescence sur un plan où les axes sont positionnés le long de l’axe du navire et de la position angulaire, et pour cartographier la distance par rapport à l’axe du navire à chaque position sur le plan projeté. La cellule a été identifiée à partir de l’image projetée à l’aide de la méthode Intermodes intégrée d’ImageJ. Les longueurs d’arc représentées par les côtés de chaque pixel associé à la cellule ont ensuite été calculées (\(l = \frac {{2\pi rd^2}}{{360}}\), où r est la distance entre le pixel associé à la cellule et l’axe du vaisseau et d est le côté d’un pixel) et utilisé pour générer des mesures de la surface de la cellule et du rapport d’aspect.
Analyse in vitro de la forme des cellules : Des HUVEC fixes ont été imagés avec un objectif d’immersion dans l’huile de silicone Olympus UPLSAPO 40×/NA 1,25. En tout, 10 à 20 images de chaque feuillet de couverture ont été prises pour être quantifiées et analysées de manière semi-automatisée à l’aide d’un script ImageJ écrit sur mesure. Les piles z multicanaux ont été projetées au maximum et le canal montrant un marqueur GFP a été identifié à partir des métadonnées de l’instrument. La méthode de seuillage Otsu intégrée d’ImageJ a été utilisée pour séparer les cellules d’intérêt de l’arrière-plan; les images binaires résultantes ont été nettoyées en supprimant les régions inférieures à 105 µm2 et les régions en contact avec la limite du champ de vision. Une étape d’intervention manuelle ultérieure a permis à l’utilisateur de modifier éventuellement des régions de cellules d’intérêt sur la base de cette image binaire pour séparer des cellules fusionnées par erreur ou inclure des cellules manquantes par l’opération de seuillage. Le script a ensuite calculé les zones et les périmètres pour chaque ROI de cellule. De plus, un « indice d’épi » a été calculé pour chaque cellule sur la base du rapport entre le périmètre de la cellule et le périmètre de la coque convexe correspondante, et une valeur du rapport d’aspect de la cellule a été calculée comme le rapport des axes majeur et mineur d’une ellipse adaptée à la cellule ROI.
Analyse du blebbing membranaire: Des tracés relatant le blebbing membranaire ont été générés de manière semi-automatisée à l’aide d’un script ImageJ écrit sur mesure. Pour chaque membrane imagée, le rapport entre la longueur de contour d’un bord de membrane et la distance euclidienne entre les extrémités de bord a été calculé à chaque point temporel. À partir des séries chronologiques résultantes, les densités spectrales de puissance ont été calculées par la méthode de welch51. La densité spectrale de puissance a ensuite été moyennée sur une fenêtre d’intérêt, définie empiriquement comme le temps caractéristique pendant lequel les blebs se sont formés (0,04–0,06 Hz); ces valeurs moyennes ont été comparées entre les conditions expérimentales (surexpression Marksl1b) et les conditions de contrôle.
Analyse de la dynamique de l’actine et de la myosine II dans les blebs: Des tracés relatant la dynamique de l’actine ou de la myosine dans les cellules blébbeuses ont été générés de manière semi-automatisée à l’aide d’un script ImageJ écrit sur mesure. Les piles z en accéléré multicanaux ont d’abord été projetées au maximum le long de la dimension z. Le logiciel a ensuite automatiquement identifié le bord d’un bleb entre deux points d’ancrage définis par l’utilisateur à tous les moments en utilisant la méthode de seuillage Otsu intégrée d’ImageJ fonctionnant sur le canal Marksl1b-EGFP comme substitut pour l’étiquetage membranaire. Après une étape de contrôle de la qualité de l’utilisateur pour assurer une identification précise du bord de bleb, le profil d’intensité du canal actine /myosine le long du bord a été extrait à chaque point temporel et tracé en fonction du temps dans un kymographe. À chaque point temporel, des statistiques d’intensité ont été extraites avec la zone de bleb, définie ici comme la zone projetée en z entourée par le bord et la ligne joignant les points de part et d’autre du bleb le plus éloigné de la pointe de bleb le long d’un axe perpendiculaire à la ligne joignant les points d’ancrage définis par l’utilisateur, et l’intensité moyenne du canal d’actine/myosine et la zone de bleb ont été tracées en fonction du temps.
Quantification de la densité d’actine corticale et de la largeur du faisceau: Des images à haute résolution de l’actine dans les HUVECs ont été acquises à l’aide d’un objectif à huile Plan-APOCHROMAT 63x monté sur un microscope confocal Zeiss LSM880 équipé d’un détecteur Airyscan et GaAsP. Des régions au carré d’environ 3 µm dans chaque observation ont été sélectionnées au hasard et découpées typiquement 8 sections optiques couvrant le maillage cortical de ces régions. Les images projetées le long de l’axe Z de piles recadrées ont été générées par projection d’intensité maximale et soumises à la procédure suivante. Comme les filaments d’actine dans l’image étaient ambigus et qu’il était impossible d’évaluer l’ensemble du réseau, nous avons quantifié le nombre de filaments d’actine dans les régions limitées comme la densité du maillage d’actine. Ceci a été réalisé en définissant des lignes de balayage le long des axes X et Y à tous les 4 pixels, et les valeurs de pixels le long de chacune des lignes de balayage ont été soumises au filtre de Savitzky-Golay52 pour calculer les dérivées du premier ordre. Les filaments d’actine ont ensuite été identifiés en trouvant des points de passage par zéro, qui sont les pics d’intensité de la ligne de balayage. Les comptages des pics ont été divisés par le nombre de pixels de la ligne de balayage (largeur ou hauteur de l’image) et la densité des filaments sur l’image a été calculée en prenant la moyenne de ces valeurs.
Pour quantifier la largeur des faisceaux d’actine, les lignes centrales des faisceaux d’actine ont été générées en trouvant des points de passage par zéro des dérivées du premier ordre calculées par le filtre de Savitzky-Golay et suivies par l’application de l’algorithme d’amincissement de Hilditch. Pour éliminer la possibilité que les points de ramification ou de croisement des filaments d’actine affectent les mesures, les points de ramification trouvés dans la lignée squelettisée ont été éliminés et segmentés. L’axe orthogonal au segment global a été déterminé en obtenant le vecteur propre, et les intensités fluorescentes ont été échantillonnées le long de l’axe orthogonal parcourant le centre de gravité du segment avec la méthode d’interpolation de Lanczos-5. Ensuite, le diamètre d’un filament a été déterminé par la largeur de la région présentant une intensité maximale supérieure ou égale à la moitié de la ligne échantillonnée le long de l’axe orthogonal au segment global.
Statistiques: L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). La taille des échantillons n’était pas prédéterminée, les expériences n’étaient pas randomisées et les chercheurs n’étaient pas aveuglés par l’allocation lors des expériences et de l’évaluation des résultats.
Résumé des rapports
De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le Résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.
