La délétion de KDM6A, une histone Déméthylase Interagissant avec MLL2, chez trois patients atteints du syndrome de Kabuki | Jumbuck

Texte principal

Le syndrome de Kabuki (KS; MIM 147920) a été décrit pour la première fois en 1981 par Niikawa et Kuroki, 1, 2 et plus de 400 cas ont été rapportés dans la littérature. Les principales caractéristiques cliniques sont des traits faciaux distinctifs, un retard de développement, une déficience intellectuelle légère à modérée, un retard de croissance postnatal et des caractéristiques supplémentaires, notamment des anomalies squelettiques, une hypodontie et des coussinets fœtaux persistants. L’analyse de microréseaux par hybridation génomique comparative (CGH) n’a pas permis de détecter une anomalie récurrente chez 72 individus KS.3-8 L’utilisation de la stratégie de séquençage des exomes a récemment conduit à l’identification des mutations MLL2 (MIM 602113) comme cause majeure de la KS.9 Dans cinq séries récemment publiées, des mutations de MLL2 ont été trouvées chez 56% à 76% des patients atteints de SK.9-13

Comme une proportion significative de patients ne présentent pas de mutation MLL2 détectable, nous avons postulé l’existence de gènes supplémentaires associés au KS. Dans la recherche d’une autre mutation génétique causant le KS, dix gènes interagissant avec MLL2 ont été dépistés chez 15 individus KS négatifs à la mutation MLL2, et aucune mutation pathogène n’a été identifiée.11 Un autre gène codant pour une protéine interagissant avec MLL2, KDM6A (précédemment connu sous le nom d’UTX; MIM 300128), a été criblé chez 22 individus KS à mutation négative MLL2, et encore une fois, aucune mutation causale n’a été détectée.13

En utilisant l’analyse de tableau CGH (plate-forme Agilent 244K), nous avons identifié des microdélétions de novo Xp11.3 chez deux filles belges KS à mutation MLL2 négative (patientes 1 et 2). Parce que les deux suppressions étaient de novo, elles sont probablement pathogènes. Les deux suppressions comprenaient une partie ou la totalité de KDM6A. De plus, il n’y avait pas de suppressions de KDM6A dans une cohorte de 411 témoins normaux dans une étude précédente.14 La délétion chez le patient 1 comprenait les exons KDM6A 21-29, qui codent pour la partie terminale du domaine catalytique de KDM6A, et CXorf36, un gène récemment impliqué dans l’autisme lié à l’X.15 Chez le patient 2, KDM6A, CXorf36, DUSP21 (MIM 300678) et FUNDC1 (Figure 1) ont été complètement retirés. Les fonctions de DUSP21 et FUNDC1 restent inconnues.

Région Xp11.3 Montrant les suppressions des patients

La région Xp11.3 montre les suppressions tirées du navigateur génomique UCSC (GRCh37/hg19) pour les patients 1, 2 et 3. Les pistes complètes noires représentent la suppression de chaque patient, et le numéro de chaque patient est au-dessus de sa piste respective. La suppression chez le patient 1 s’étend sur 283,5 ko de la base 44 941 324 à la base 45 224 829, la suppression du patient 2 s’étend sur 815.7 ko de la base 44 377 858 à la base 45 193 629, et la suppression du patient 3 s’étend sur 45,4 ko de la base 44 866 302 à la base 44 912 718. Les gènes dans la région sont notés sous les traces de délétion. Les CNV de la base de données des variants génomiques sont indiqués sur les lignes du bas. Il n’y a pas de rapports précédents de modifications du numéro de copie KDM6A.

Nous avons ensuite séquencé KDM6A par séquençage de Sanger et avons cherché des délétions ou des duplications intragéniques avec un tableau Agilent personnalisé ciblé CGH dans une cohorte de 22 individus KS à mutation MLL2 négative (8 femelles, 14 mâles). Conformément aux normes éthiques du comité d’éthique de l’Institut de Pathologie et de Génétique, le consentement parental a été obtenu pour l’analyse ADN de tous les participants à cette étude et pour la publication de photographies. Les données sur les microréseaux CGH (données supplémentaires, disponibles en ligne) discutées dans cette publication ont été déposées au Centre National d’Information sur la biotechnologie (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) 16 et sont accessibles sous la référence d’adhésion GSE32567 (voir la section Numéros d’adhésion).

Aucune mutation ponctuelle n’a été détectée, mais nous avons identifié une délétion intragénique de novo (exons 5-9) chez un individu KS italien de sexe masculin (patient 3). Nous avons également séquencé UTY (MIM 400009), le paraloge du chromosome Y de KDM6A (voir ci-dessous), et cherché des délétions ou des duplications intragéniques comme indiqué ci-dessus, mais nous n’avons détecté aucune mutation.

Les patients 1 et 3 présentaient un phénotype KS typique, comprenant de longues fissures palpébrales, une éversion latérale de la paupière inférieure et une déficience intellectuelle modérée à sévère (tableau 1 et figure 2). Bien que les traits du visage de la patiente 2 ne soient pas aussi classiques, elle présentait de nombreuses caractéristiques de ce trouble, notamment une parcimonie latérale des sourcils, de longs cils, un strabisme, de longues fissures palpébrales, de grandes oreilles proéminentes, des coussinets fœtaux persistants, une coarctation aortique, une plénitude aréolaire dans la petite enfance et un hirsutisme. Elle présentait un léger retard de développement et avait un score normal de quotient intellectuel verbal (QI), un score de QI de performance médiocre et un comportement hyperactif (tableau 1 et figure 2). Nous avons noté que les patients 1 et 2 avaient de longues hallucinations (Figure 3).

Apparence du visage chez les Personnes atteintes

(A) Patient 1.

(B) Patient 2.

(C) Patient 3.

Notez les longues fissures palpébrales chez les patients 1 et 2 et les sourcils arqués chez les patients 1 (légers) et 3.

Apparition des pieds chez les Personnes atteintes

(A) Patient 1.

(B) Patient 2.

Notez les longues hallucinations chez les deux patients.

Ainsi, les délétions de KDM6A chez ces trois patients sont associées à un large spectre phénotypique allant des individus typiques de KS (patients 1 et 3) à une présentation clinique plus douce (patient 2). Cette variabilité clinique est également une caractéristique des patients présentant des mutations MLL2.13 Cependant, les effets possibles de la délétion de CXorf36 chez le patient 1 et de la délétion de CXorf36, DUSP21 et FUNDC1 chez le patient 2 sur leurs phénotypes respectifs doivent également être pris en compte.

KDM6A (29 exons) est l’un des gènes du chromosome X qui échappe largement à l’inactivation de l’X.17 Il code pour une protéine résiduelle 1 401 qui contient deux domaines fonctionnels. Le domaine catalytique est une histone déméthylase qui catalyse spécifiquement la déméthylation de la lysine 27 mono, di et triméthylée sur l’histone H3 (H3K27).18,19 Cette déméthylation médie l’expression tissulaire spécifique de divers gènes et est principalement impliquée dans les processus de développement et le cycle cellulaire.19-22 Fait intéressant, KDM6A et MLL2 agissent ensemble dans le contrôle épigénétique de la chromatine transcriptionnellement active en contrecarrant les protéines du groupe Polycomb (PcG).22 L’autre domaine fonctionnel de KDM6A joue un rôle dans le remodelage de la chromatine en interagissant avec le complexe de remodelage commutateur / saccharose non fermentable (SWI / SNF) qui contient l’activateur de transcription Brg1.23

Comme MLL2, KDM6A joue un rôle dans l’embryogenèse et le développement. dUTX homozygote (Drosophila KDM6A ortholog) Les mutants de la Drosophile manifestent des yeux rugueux, des ailes dysmorphes et une modification des peignes sexuels.21 Ce phénotype ressemble au phénotype du trithorax, ce qui soutient davantage l’idée que le KDM6A contrecarre la répression du PcG.21 De plus, UTX-1 (C. elegans KDM6A ortholog) pourrait influer sur les décisions de développement des cellules précurseurs vulvaires de C. elegans via la régulation de la transcription des gènes codant pour le complexe protéique du rétinoblastome (RB), qui a été conservé des vers à l’homme.20 Kdm6a1 est également important dans l’expression des gènes HOX postérieurs chez le poisson zèbre.19 De plus, KDM6A, avec MLL2, joue un rôle majeur dans la régulation des gènes spécifiques aux muscles pendant l’embryogenèse.22,24 Enfin, les membres d’une autre famille de gènes de développement importante (les gènes T-box, qui agissent dans le mésoderme dans la formation du cœur et des vertèbres) recrutent KDM6A pour activer leurs gènes cibles, soulignant à nouveau le rôle de KDM6A dans les processus de développement.23 Fait intéressant, la plupart des mutations pathogènes pour les gènes T-box signalés dans les maladies humaines sont situées dans le domaine T-box qui interagit avec KDM6A.23

KDM6A échappe à l’inactivation X,17 mais il a été suggéré que chez la souris, l’expression de Kdm6a à partir du chromosome X inactif est significativement plus faible que celle du chromosome X actif.L’expression de 25 Kdm6a est plus élevée dans le cerveau adulte, le foie adulte et des régions spécifiques du cerveau en développement chez les femelles que chez les mâles.25 is est le paraloge de KDM6A sur le chromosome Y.17 UTY a 84% de similitude de séquence d’acides aminés avec KDM6A et pourrait compenser l’expression accrue de KDM6A chez les femelles, malgré le fait que l’activité de la déméthylase n’a pas encore été démontrée pour ce paralogue KDM6A.14,25

Il n’est pas surprenant de trouver un autre gène associé à KS sur le chromosome X, car des cas de patients de type KS avec des chromosomes à petit anneau X(r) ont été rapportés.26-34 En outre, il existe un chevauchement évident entre les malformations cardiaques congénitales prévalentes chez les patients masculins atteints de KS (coarctation aortique et autres obstructions du côté gauche) et celles observées chez les patients atteints de monosomie X et de chromosomes r (X).28,35 Petits chromosomes r (X) conduisent généralement au syndrome de Turner par l’inactivation complète du r (X). Cependant, on ne sait pas pourquoi certaines personnes développent un phénotype de type KS. L’inactivation incomplète du chromosome X et l’expression ultérieure de gènes habituellement réprimés ont été suggérées comme explication du phénotype KS chez certains patients r(X).32-34 KDM6A a été supprimé chez les trois patients présentant à la fois un phénotype de type KS et un r(X) dans lequel les points d’arrêt avaient été cartographiés; cette découverte est cohérente avec l’hypothèse selon laquelle la délétion de KDM6A joue un rôle important dans le phénotype de type KS observé chez certains patients présentant un r(X).30,32,34 Nous n’avons pas pu prouver l’haploinsuffisance de KDM6A chez les patients 1 et 2 car l’expression de KDM6A était très faible dans les lymphocytes du sang périphérique (données non présentées). Néanmoins, des études ont montré que deux copies de Kdm6a sont nécessaires pour une expression normale chez des embryons de souris femelles et des souris adultes,25 suggérant que l’haploinsuffisance pourrait être le mécanisme pathogène. Cependant, cette explication ne rendrait pas compte du fait que les patients 45, X et autres patients r(X) avec une délétion KDM6A ne développent pas tous le phénotype Kabuki.

Chez les patients 1 et 2, les rapports d’inactivation moléculaire X sont fortement biaisés et sont respectivement de 89:11 et 97:3. Le profil d’inactivation X a été déterminé par amplification PCR de la répétition CAG dans l’exon 1 du gène récepteur des androgènes avant et après la digestion de l’ADN avec HpaII et CfoI. Pour déterminer si la copie supprimée de KDM6A était située sur le chromosome X actif ou inactif, nous avons effectué une analyse d’hybridation in situ par fluorescence (FISH) avec une sonde KDM6A sur les chromosomes X qui avaient été marqués différemment par l’incorporation de 5-bromo-2′-désoxyuridine (5-BrdU). Les résultats ont montré que la copie supprimée de KDM6A était située sur le chromosome X inactif dans l’ensemble des 70 mitoses analysées chez les deux patients (figure 4). Le fait que KDM6A échappe à l’inactivation de l’x17 suggère que les lymphocytes stimulés par la phytohémagglutinine (PHA) qui ont une copie délétée de KDM6A sur le chromosome X inactif ont un avantage de survie par rapport aux lignées cellulaires qui ont une copie délétée de KDM6A sur le chromosome X actif. Cette suggestion est conforme à l’hypothèse selon laquelle bien que KDM6A échappe à l’inactivation X, son expression est plus faible à partir du chromosome X inactif qu’à partir du chromosome X actif.25

Image d’une étude sur des POISSONS sur des chromosomes X marqués de manière différentielle avec du 5-BrdU

Une image d’une étude sur des POISSONS montre des chromosomes X marqués de manière différentielle par l’incorporation de 5-BrdU. Le chromosome X inactif (dans le cercle blanc) semble plus lumineux que le chromosome X actif. Les sondes subtélomères Xqter s’hybrident aux deux chromosomes X (flèches bleues). Le signal KDM6A (flèche blanche) est absent du chromosome X inactif et est présent sur le chromosome X actif. Pour cette expérience, les lymphocytes du sang périphérique des patients 1 et 2 ont été stimulés par la phytohémagglutinine et ont été cultivés pendant 72 heures. Afin d’identifier le chromosome X inactif à réplication tardive, nous avons traité les cellules avec du 5-BrdU (30 µg / ml) 5 heures avant la récolte. Le colcémide a ensuite été ajouté à une concentration de 0,2 µg / ml, et 1 heure plus tard, des préparations de métaphases ont été produites par des procédures standard impliquant un gonflement dans du KCl de 75 mM et une fixation dans du méthanol 3: 1 / acide acétique. Nous avons effectué une analyse des POISSONS en utilisant simultanément une sonde Xqter subtélomérique marquée avec SpectrumOrange (Vysis) pour indiquer les chromosomes X (flèche bleue) et RP11-435K1 marquée avec SpectrumOrange (AmpliTech) pour distinguer les chromosomes X supprimés et non séparés (flèche blanche). Pour faciliter la détection de la 5-BrdU incorporée, nous avons dénaturé l’ADN cellulaire dans du HCl 2N pendant 30 min à 37°C. La 5-BrdU a ensuite été marquée avec un anticorps monoclonal spécifique de la 5-BrdU conjugué à la fluorescéine (Roche) (1 µg/ml). Enfin, nous avons contre-coloré l’ADN en appliquant une solution antifade contenant 0.1 µg/ml de DAPI.

Le rôle de UTY est largement inconnu et il n’a pas d’activité déméthylase in vitro. La découverte d’un individu KS masculin (patient 3) avec une délétion intragénique de KDM6A et avec une sévérité clinique similaire à celle du patient 1 suggère que UTY pourrait partiellement compenser la perte de KDM6A chez les individus masculins, comme suggéré précédemment dans la littérature.25

Comme pour MLL2, des mutations somatiques homozygotes et hémizygotes de KDM6A ont été identifiées dans divers types de cancer (myélome multiple, carcinome épidermoïde de l’œsophage, carcinome à cellules rénales, leucémie myéloïde, cancer du sein, cancer colorectal et glioblastome), suggérant que KDM6A est un gène suppresseur de tumeur.14 Néanmoins, le cancer n’est pas une caractéristique clé du SK, étant donné que cette complication n’a été rapportée que chez sept patients du SK36,37 (une leucémie lymphoblastique aiguë, un lymphome de Burkitt, un sarcome fibromyxoïde, un sarcome synovial et un hépatoblastome ont été rapportés une fois, et un neuroblastome a été rapporté chez deux personnes du SK).35,36 Si la perte des deux allèles est suffisante pour provoquer un cancer, on s’attendrait à ce que le cancer se produise plus fréquemment dans le KS, comme dans le rétinoblastome (MIM 180200) ou la tumeur de Wilms (MIM 194070). Cela suggère soit que la perte du deuxième allèle dans MLL2, KDM6A, soit UTY est nécessaire mais pas suffisante pour le développement du cancer, soit que cette complication est sous-reconnue, démontrant l’importance des études d’histoire naturelle dans les syndromes rares.37

Les histones méthylases et les histones déméthylases suivantes ont été impliquées dans d’autres syndromes à anomalies multiples : EHMT1 (MIM 607001; syndrome de Kleefstra), SETBP1 (MIM 611060; syndrome de Schinzel-Giedion), JARID1C (MIM 314690; Syndrome de retard mental lié à l’X de type Claes-Jensen), PHF8 (MIM 300560; Syndrome de retard mental de type Siderius, lié à l’X), et MLL2 dans KS. L’identification des mutations pathogènes de KDM6A chez les patients atteints de KS élargit le rôle des facteurs de modification des histones dans la déficience intellectuelle et la malformation congénitale.

En conclusion, nous rapportons des mutations KDM6A comme cause de KS chez un mâle et deux femelles. Nos résultats confirment à la fois l’hétérogénéité génétique de KS et un locus sur le chromosome X, comme cela a été suggéré précédemment. Étant donné que certains patients atteints de KS étaient négatifs pour le séquençage MLL2, KDM6A et UTY et n’ont pas montré de délétions ou de duplications lors du dépistage, il est probable que d’autres gènes associés à KS restent à découvrir.