Production de L-phényl Acétyl Carbinol (L-PAC) par Différentes Nouvelles Souches de Levures dans la mélasse et le Jus de Canne à Sucre comme Milieu de production

Introduction

La biotechnologie utilise des micro-organismes ainsi que des cellules supérieures et leurs principes actifs dans le but de réaliser des conversions souhaitables de divers substrats (Tripathi et al., 1997). Le L-phényl acétyl carbinol est le matériau de départ de la synthèse chimique de l’hydrochlorure de L-éphédrine et des composés pharmaceutiques pseudo-éphédrine utilisés comme décongestionnants et antiasthmatiques (Shin et Rogers, 1995) et récemment rapportés, utilisés dans le contrôle de l’obésité (Astrup et al., 1992). Le substrat aromatique benzaldéhyde donnera du L-PAC par méthode de biotransformation. Certaines souches de levure possèdent des enzymes pyruvate décaroxylase (PDC) et alchol déshydrogénase (ADH) qui produisent du L-PAC et de l’alcool benzylique, un sous-produit, respectivement à partir du benzaldéhyde (Nikolova et Ward, 1991). Les potentiels de biotransformation des cellules en croissance cellules récoltées libres cellules immobilisées et enzymes brutes isolées ainsi que purifiées ont été largement étudiés par bee n (Liew et al., 1995; Shin et Rogers, 1996a, b).

Le rôle des nouvelles souches dans la bioconversion est un aspect important. La production de L-PAC a été étudiée par des cellules libres et immobilisées de saccharomyces cerevisiae dans diverses conditions de croissance et de biotransformation. Mais nous avons étudié la production de L-PAC à partir de benzaldéhyde en utilisant diverses souches nouvelles selon diverses modalités de croissance et de biotransformation en vue de surveiller les conditions idéales permettant un rendement maximal du produit à concentration de substrat et densité cellulaire constantes. La production de L-PAC est donnée dans le schéma 1.

Matériaux et méthodes

Production de L-phényl Acétyl Carbinol avec des cellules normales de Sccharomuces Cerevisiae (BY)
La production de L-Pac (un intermédiaire clé pour de nombreux médicaments) à partir de benzaldéhyde par les levures est la voie potentielle dans l’industrie de la fermentation pour la production d’éphédrine et d’autres médicaments. La présente étude a été menée par l’auteur au collège de pharmacie Sultan-Ul-Uloom, situé à Hyderabad, en Inde, en 2004.La culture mère de levure de boulanger a été fraîchement repiquée (Ellaiah et Krishna, 1987) sur des pentes fraîches stériles de milieu YEMA et incubée à température ambiante (environ 28 ° C) pendant 36 h. Ainsi, la culture de 36 h a été utilisée pour la récolte. La culture de levure de boulangerie a été récoltée par agitation dans 5 mL d’eau stérile. La suspension microbienne récoltée a été transférée dans le milieu d’inoculum-I. La composition du milieu d’inoculum est la suivante:

Le ballon a été incubé à 28°C sur un agitateur rotatif (180 tr/min) pendant 24 h.

Le comptage microbien a été effectué à l’aide de la chambre de comptage Neubauer. La suspension microbienne a été diluée pour que chaque mL de suspension contienne 200×106 cellules. Dix millilitre d’inoculum d’IM-I ont été transférés dans 100 mL de milieu d’inoculation-II dont la composition est indiquée ci-dessous:

Les flacons ont été incubés sur un agitateur rotatif (180 tr/min) pendant 16 h.

Cent millilitre de milieu de production ont été préparés. Dans la majeure partie de l’étude, le milieu de mélasse utilisé comme milieu de production et pour l’étude de comparaison, le milieu de jus de canne à sucre avec l’urée a été utilisé comme milieu de production. Dix millilitre d’inoculum d’IM-II ont été transférés dans des milieux de production de composition identique à IM-II et incubés pendant 9 h sur agitateur rotatif. À 9 h, un nutriment (20 mL de mélasse à 50%) a été ajouté au milieu de production de mélasse et un nutriment (20 mL de jus de canne à sucre à 50%) a été ajouté au milieu de production de canne à sucre respectivement et incubé sur un agitateur rotatif. À partir de 10 h 0.6% de benzaldéhyde distillé ont été ajoutés en 6 doses fractionnées d’une demi-heure d’intervalle au milieu de production.

Ensuite, des flacons ont été incubés sur l’agitateur rotatif pendant 24 h. les flacons contenant 130 mL de bouillon (soit 100 mL de milieu de production + 10 mL d’inoculum + 20 mL de milieu nutritif) ont été traités avec 130 mL de benzène (solvant) et agités pendant 15 min dans des entonnoirs de séparation. Ensuite, la couche organique a été séparée et filtrée à travers du coton absorbant. Enfin, le solvant benzène a été distillé pour obtenir le produit L-PAC.

Production de L-phényl Acétyl Carbinol avec de Nouveaux Isolats de Levures:
Procédures de bioconversion:
Dans des études comparatives, les nouvelles cultures ont été utilisées pour estimer et comparer leur potentiel de biotransformation avec la levure de boulangerie. Les cultures de stock de Candida pseudointermedia MTCC n ° 6225, Candida pseudountermedia MTCC n ° 6352 et Issatchenkia orientalis MTCC n ° 6351 ont été repiquées de manière aseptique sur des pentes de YEMA Strile avec boucle de transfert stérilisée dans la zone stérile (flux d’air laminaire).

La procédure mentionnée précédemment (Ellaiah et Krishna, 1987) a également été répétée pour les nouvelles souches. Dans la majeure partie de l’étude, le milieu de mélasse a été utilisé comme milieu de production et, pour l’étude comparative, le milieu de jus de canne à sucre avec de l’urée (Kaur et Kocher, 2002) a été utilisé comme milieu de production.

Résultats et discussion

Le L-phényl acétyl carbinol est un liquide de couleur jaune. Sa densité rapportée est de 0,93 à température ambiante. Le L-PAC produit par des isolats comprenant des levures de boulangerie (S.cerevisia) a montré la même valeur de densité spécifique. La valeur du pH du L-PAC (rapport 1: 1 de l’échantillon de L-PAC et de l’eau) est de 3,84. Dans ces expériences, le produit L-PAC obtenu par biotransformation par quatre levures différentes comme la levure de boulanger, Candida pseudointermedia (6225), Candida pseudointermedia (6352) et Issatchenkia orientials (6351) ont montré les mêmes valeurs de pH. La valeur rf du L-PAC a été rapportée (Groger et Erge, 1965) dans le chloroforme, car la phase mobile sur les vapeurs d’iode de gel de silice a été utilisée pour la détection des taches.

Dans le développement des chromatogrammes, le chloroforme en tant que solvant frontal a été comparé au mélange de solvants (acétate d’éthyle à 30% et hexane à 70%) en tant que phase mobile. Le front de solvant plus tardif a montré une meilleure séparation que le chloroforme. Nous avons donc utilisé 30% d’acétate d’éthyle et 70% d’hexane comme solvant avant dans toutes nos expériences.

Le L-PAC est réactif dans la lumière UV, les vapeurs d’iode et la carbonisation du β-Méthoxynaphtalène également. La valeur Rf du L-PAC standard est d’environ 0,33. Le produit L-PAC de différents isolats a montré la même valeur Rf.

La méthylcétone présente dans le L-PAC subit la réaction d’Idoforme (Smith et Hendlin, 1954). Il subit initialement une halogénation et le clivage en présence d’alcali comme le NaOH pour donner naissance à l’Idoforme. Cette réaction est très spécifique du L-PAC et ne se produit pas avec les sous-produits. Le L-PAC produit par différents isolats a donné naissance à l’Idoforme.

Par des estimations polarimétriques et colorimétriques, le pourcentage de bioconversion a été estimé dans différents isolats de levure. D’autres produits de fermentation (p. ex. l’alcool benzylique, l’acide benzoïque ainsi que le benzaldéhyde non converti ont été dosés par Chromatographie en phase liquide à Haute performance (CLHP) et Chromatographie en phase gazeuse (GC). La structure chimique du L-PAC a été identifiée et conforme aux données spectrales RMN 1H et UV.

Plusieurs travailleurs (Ellaiah et Krishna, 1987) ont procédé à une fermentation dans de la mélasse comme milieu de production, en plus de celle utilisée dans l’industrie pour la réaction de bioconversion dans la production de L-PAC.

Dans la présente enquête, nous avons essayé le jus de canne à sucre comme moyen de production dans la production de L-PAC. Le jus de canne à sucre contenant 0,25% d’urée a été utilisé comme milieu de production, ce qui a donné plus de produit de L-PAC que de mélasse. En plus de ce produit, l’extraction du milieu de jus de canne à sucre était très pratique que celle du milieu de mélasse. Le % de bioconversion obtenu avec différents isolats de levure est indiqué dans le tableau 1.

Le potentiel de biotransformation des cellules libres de la levure de boulangerie (S.cerevisiae) a été étudié dans la mélasse et le jus de canne à sucre comme milieu de production. Dans le milieu de mélasse, une bioconversion de 25% a été observée, tandis que dans le milieu de jus de canne à sucre, une bioconversion de 28% a été observée.

Le potentiel de biotransformation des cellules libres de Candida pseudointermedia MTCC No 6225 a été étudié dans la mélasse et le jus de canne à sucre comme milieu de production. Dans la mélasse, une bioconversion de 23,43% a été observée, tandis que dans le milieu du jus de canne à sucre, une bioconversion de 23,75% a été observée.

Potentiel de biotransformation des cellules libres de Candida pseudointermedia MTCC No. 6352 a été étudié dans la mélasse et le jus de canne à sucre comme milieu de production. Dans la mélasse, une bioconversion de 33,47% a été observée, tandis que dans le milieu du jus de canne à sucre, une bioconversion de 48,76% a été observée.

Le potentiel de biotransformation des cellules libres d’Issatchenkia orientalis MTCC No 6351 a été étudié dans la mélasse et le jus de canne à sucre comme milieu de production. Dans la mélasse, une bioconversion de 37,16% a été observée, tandis que dans le milieu du jus de canne à sucre, une bioconversion de 60,61% a été observée.

Conclusion

En conclusion, la présente procédure d’utilisation de nouvelles souches de levures de sources naturelles pour des études de biotransformation a été étudiée et utilisée pour la bioconversion du benzaldéhyde en L-PAC. Trois souches ont été isolées de différentes sources naturelles telles que les raisins noirs, les dattes et le jus de canne à sucre et ont été identifiées à l’Institut de technologie microbienne de Chandigarh. Ces trois souches ont été désignées comme Candida pseudointermedia MTCC n° 6225 (BGY), Issatchenkia orientials MTCC n° 6351 (DY), Candida pseudointermedia MTCC n° 6352 (SCY).Ce qui constituera un ajout important aux procédures existantes. Les résultats les plus significatifs de la présente recherche sont l’utilisation de 3 nouvelles souches de levures pour la production de L-PAC et l’utilisation de jus de canne à sucre comme milieu de production pour la production de L-PAC. Nous réussissons dans les deux tentatives et il y a une augmentation considérable du rendement en pourcentage de L-L-PAC lorsque le jus de canne à sucre a été utilisé comme milieu de production. Bien que le jus de canne à sucre soit cher par rapport à la mélasse, la procédure d’extraction s’est avérée beaucoup plus facile avec le jus de canne à sucre par rapport à la mélasse. D’autres modalités de recherche telles que différents facteurs, études d’immobilisation, études de mutation, etc., pourrait aider à établir les méthodes rentables pour la production de L-PAC en utilisant le jus de canne à sucre comme milieu de production. Il s’agit du premier rapport sur l’utilisation de Candida pseudointermedia et d’Issatchenkia orientalis pour des études de bioconversion du benzaldéhyde en L-PAC. L’utilisation du jus de canne à sucre comme milieu de production dans les études de biotransformation du benzaldéhyde en L-PAC est également le premier rapport du genre. De plus, le jus de canne à sucre a montré un potentiel de bioconversion accru par rapport au milieu de mélasse. Les nouvelles souches que nous pouvons explorer pour les différentes réactions chimiques. D’autres études dans ce sens sont en cours.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants à IMTECH, Chandigarh, d’avoir identifié les nouvelles souches et d’avoir attribué les numéros de MTCC.