Purification et caractérisation de l’Asparaginase à partir de graines de Phaseolus vulgaris

Résumé

La L-asparaginase de bactéries a été utilisée dans le traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë. Le but de cette étude était de purifier et de caractériser la L-asparaginase des graines de Phaseolus vulgaris au lieu de sources microbiennes. La L-asparaginase a été purifiée jusqu’à homogénéité apparente. L’enzyme a une masse moléculaire de 79 kDa. L’asparaginase purifiée avait une très faible activité vis-à-vis d’un certain nombre d’analogues de l’asparagine et de la glutamine. La L-asparaginase était exempte d’activité glutaminase. Les paramètres cinétiques, Km et Vmax de l’enzyme purifiée, ont été trouvés à 6,72 mM et 0,16 µM, respectivement. L’enzyme avait un pH optimal à 8,0. L’enzyme a montré une grande stabilité à un pH alcalin (pH 7,5–9,0) lorsqu’elle a été incubée jusqu’à 24 h. La L-asparaginase avait la même température optimale et la même stabilité thermique à 37 ° C. K + a pu augmenter considérablement l’activité de l’asparaginase de 150% par rapport aux autres métaux testés. En conclusion, la L-asparaginase n’a montré aucune activité glutaminase et une bonne stabilité dans un large éventail de conditions physiologiques, et pourrait donc être utilisée comme candidat potentiel pour le traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë.

1. Introduction

La L-asparaginase (L-asparagine amidohydrolase E.C.3.5.1.1) est utilisée dans le traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë et du lymphome non Hodgkinien. L’utilisation de la L-asparaginase en thérapie anticancéreuse est basée sur sa capacité à cliver la L-asparagine, un acide aminé essentiel à la croissance des lymphoblastes, en ammoniac et en acide L-aspartique dans le sérum et le liquide céphalo-rachidien, car les lymphoblastes sont incapables de produire de la L-asparagine endogène, ce qui entraîne la mort de ces cellules. La plupart des cellules cancéreuses dépendent d’une source exogène de cet acide aminé pour leur survie. Cependant, les cellules normales sont capables de synthétiser la L-asparagine et sont donc moins affectées par son épuisement rapide dû au traitement avec cette enzyme. La L-asparaginase peut également être utilisée pour réduire la formation d’acrylamide dans les aliments frits et cuits au four, en particulier dans les croustilles. La formation d’acrylamide a été attribuée à la réaction de l’asparagine libre et des sucres réducteurs. L’épuisement de l’asparagine par l’asparaginase a empêché la formation d’acrylamide.

La L-asparaginase est largement distribuée parmi les plantes, les animaux et les microorganismes. Chez les plantes, cette enzyme a d’abord été détectée dans les graines en développement de Lupinus albus. L’asparaginase a également été purifiée à partir du testa des graines en maturation de L. polyphylllus. Deux formes de l’enzyme ont été identifiées. Une forme indépendante de K+ se trouve chez L. arboreus et L. polyphyllus et une forme dépendante de K+ se trouve chez Pisum sativum et plusieurs autres espèces de légumineuses, y compris d’autres espèces de Lupinus. Le travail avec des anticorps dirigés contre la forme indépendante de K+ de L. polyphylllus n’a révélé aucune réaction croisée avec l’asparaginase de pois ou un certain nombre de variétés de Lupinus contenant l’enzyme dépendante de K+, suggérant que les deux formes d’asparaginase sont immunologiquement distinctes.

Très peu d’informations ont été rapportées sur l’utilisation de l’asparaginase végétale dans le traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë. Par conséquent, l’objectif principal de cette étude était de purifier et de caractériser la L-asparaginase des graines de Phaseolus vulgaris exemptes de L-glutaminase au lieu de la L-asparaginase provenant de sources microbiennes qui est utilisée comme anticancéreuse et a provoqué des effets secondaires dus à ses réponses immunologiques.

2. Matériel et méthodes

2.1. Matériel végétal

Graines matures de Phaseolus vulgaris cv. Gizeh 6 ont été obtenus auprès du Centre de recherche agricole du Caire, en Égypte.

2.2. Purification de l’Asparaginase

2.2.1. Extrait brut

L’extrait brut d’asparaginase a été préparé par homogénéisation de 50 g de graines de Phaseolus vulgaris cv. Gizeh 6 dans un tampon Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0 contenant 10% de glycérol, 50 mm de KCl, 12,5 mm de β-mercaptoéthanol et 1 mm de PMSF. L’homogénéat est centrifugé à 10 000 ×g et le surnageant est désigné comme extrait brut. L’extrait brut a été concentré par dialyse contre du saccharose solide.

2.2.2. Colonne DE DEAE-Sépharose

Un extrait brut concentré a été appliqué sur une colonne DE DEAE-Sépharose (15 × 1,6 cm i.d.) préalablement équilibrée avec un tampon Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0. L’enzyme a été éluée par différentes concentrations de KCl préparées dans le même tampon à un débit de 60 mL/h et des fractions de 3 mL ont été recueillies. Trois pics de protéines ont été élués avec une activité asparaginase selon l’ordre d’élution (asparaginases I, II et III).

2.2.3. L’asparaginase I Séphacryle S-200

avec la plus forte activité a été appliquée sur une colonne Séphacryle S-200 (90 ×0.6 cm i.d.) qui a été préalablement équilibré avec le même tampon à un débit de 30 mL/h et des fractions de 3 mL ont été collectées.

2.3. Dosage de l’asparaginase

L’activité de la L-asparaginase a été mesurée par une méthode modifiée de Wriston. La L-asparaginase catalyse la L-asparagine en acide L-aspartique et en ammoniac et ces derniers réagissent avec le réactif de Nessler pour produire un produit de couleur orange. Le mélange de dosage enzymatique est constitué de 900 µL de L-asparagine fraîchement préparée (20 mM) dans un tampon Tris-HCl de 50 mM (pH 8,0), de 50 mm de KCl et de 100 µL d’extrait brut de l’enzyme. Le mélange réactionnel a été incubé à 37°C pendant 30 min et la réaction a été arrêtée par ajout de 100 µL d’acide trichloracétique à 15%. Le mélange réactionnel est centrifugé à 10 000 xg pendant 5 min à 4°C pour éliminer les précipités. L’ammoniac libéré dans le surnageant a été déterminé par technique colorimétrique en ajoutant 100 µL de réactif de Nessler dans l’échantillon contenant 100 µL de surnageant et 800 µL d’eau distillée. Les teneurs de l’échantillon ont été tourbillonnées et incubées à température ambiante pendant 10 min et la DO a été mesurée à 425 nm. L’ammoniac produit dans la réaction a été déterminé sur la base de la courbe étalon obtenue avec du sulfate d’ammonium. Une unité d’activité de la L-asparaginase est définie comme la quantité de l’enzyme qui libère 1 µmol d’ammoniac par minute à 37°C

2,4. Détermination de la protéine

La protéine a été quantifiée par la méthode de Bradford avec de l’albumine sérique bovine en standard.

2.5. Détermination du poids moléculaire

Le poids moléculaire natif a été déterminé par Sephacryl S-200. La colonne a été étalonnée avec le cytochrome C (12 400), l’anhydrase carbonique (29 000), l’albumine sérique bovine (67 000), l’alcool déshydrogénase (150 000) et la β-amylase (200 000). Le bleu de dextrane (2 000 000) a été utilisé pour déterminer le volume de vide (Vo). Le poids moléculaire de la sous-unité a été estimé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS. La phosphorylase b dénaturée par la SDS (94 000), l’albumine sérique bovine (67 000), l’ovalbumine (43 000), l’anhydrase carbonique (30 000), l’inhibiteur de la trypsine de soja (20 000) et l’α-lactalbumine (14 200) ont été utilisés pour la courbe d’étalonnage.

2.6. Caractérisation de l’Asparaginase

2.6.1. La spécificité du substrat

L’activité de l’asparaginase a été déterminée avec certains analogues de la L-asparagine. L’activité relative a été exprimée comme le rapport en pourcentage de l’activité enzymatique déterminée par rapport à différents analogues de structure de la L-asparagine à l’activité enzymatique avec la L-asparagine.

2.6.2. Paramètres cinétiques

Les valeurs des constantes de Michaelis (Km) et de la vitesse maximale (Vmax) ont été déterminées en utilisant la L-asparagine comme substrat dans la plage de 2 à 20 mM. Les paramètres cinétiques ont été déterminés à partir du tracé Lineweaver-Burk.

2.6.3. Effet du pH

Le pH optimal pour l’activité asparaginase a été déterminé en dosant l’activité à différentes valeurs de pH. La stabilité du pH a été testée par incubation de l’enzyme à un pH de 5,0–9,0 pendant 24 h à 4°C en l’absence de substrat et l’activité résiduelle a été déterminée dans les conditions de dosage standard.

2.6.4. Effet de la température

La température optimale pour l’activité de l’asparaginase a été déterminée en dosant l’enzyme à différentes températures. La stabilité thermique a été mesurée en incubant l’enzyme seule à différentes températures pendant 1 h. Après traitement thermique, la solution d’enzyme a été refroidie et l’activité résiduelle a été dosée après ajout des substrats.

2.6.5. Effet des ions métalliques

Les effets de divers ions métalliques sur l’activité enzymatique ont été déterminés en préincubant l’enzyme seule avec des ions métalliques de 10 mM pendant 15 min avant l’ajout du substrat. L’activité qui a été dosée en l’absence d’ions métalliques a été prise à 100%.

3. Résultats et discussion

Les résultats des étapes de purification de l’asparaginase de P. vulgaris sont résumés dans le tableau 1. Le profil d’élution de la chromatographie sur colonne DEAE-Sépharose (Figure 1) a montré trois pics de protéines à activité asparaginase. Un pic avec l’activité asparaginase la plus élevée a été appliqué sur une colonne Sephacryl S-200 (Figure 2). La L-asparaginase I a été purifiée 21,7 fois avec une activité spécifique 846 unités / mg de protéine. L’asparaginase I s’est avérée pure après la colonne Sephacryl S-200 telle qu’évaluée par SDS-PAGE (Figure 3). Le poids moléculaire de l’asparaginase I par les procédures Sephacryl S-200 et SDS-PAGE a donné une valeur de 79 kDa en tant que sous-unité monomère. Cette découverte est en accord avec les poids moléculaires des asparaginases de Vigna unguiculata (70 kDa) et de Lupinus polyphylllus (75 kDa). Un poids moléculaire moyen de 58 kDa a été détecté pour l’asparaginase des feuilles de pois. Pour les asparaginases bactériennes, le poids moléculaire variait de 140 à 160 kDa avec des sous-unités tétramères. Un poids moléculaire très faible de 11,2 kDa a été détecté pour Streptobacillus sp. KK2S4 asparaginase.

Figure 1

Un profil d’élution typique pour la chromatographie de l’asparaginase de P. vulgaris sur colonne DE DEAE-Sépharose (15 × 1,6 cm i.d.) préalablement équilibrés avec du tampon Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0 à un débit de 60 mL/h et des fractions de 3 mL.

Figure 2

Filtration sur gel de l’asparaginase I de la fraction DE DEAE-Sépharose sur colonne Sephacryl S-200 (90 × 1,6 cm i.d.). La colonne a été équilibrée avec du tampon Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0 à un débit de 30 mL/h et des fractions de 3 mL.

Figure 3

SDS-PAGE pour la détermination de l’homogénéité et du poids moléculaire de l’asparaginase I de Phaseolus vulgaris. (1) Marqueurs protéiques; (2) Sephacryl S-200 asparaginase I.

La spécificité du substrat de l’asparaginase I a été examinée à l’aide d’un certain nombre d’analogues de l’asparagine et de la glutamine (tableau 2). L’activité avec la L-asparagine a été considérée comme une activité à 100%. La DL-asparagine présente 30% de l’activité enzymatique, où la DL-asparagine est composée de 1 : 1 mélange racémique. Les analogues de la D-asparagine, de l’acide L-aspartique et de l’acide L-glutamique avaient une très faible activité vis-à-vis de l’asparaginase I. Aucune activité n’a été détectée en présence de L-glutamine. Par conséquent, l’asparaginase I de P. vulgaris est exempte de glutaminase. La contamination de l’asparaginase par l’activité de la glutaminase a provoqué des effets secondaires au cours du traitement anticancéreux. L’asparaginase de L. arboreus n’hydrolysait que la L-asparagine et le DL-aspartyl hydroxamate. L’asparaginase de V. unguiculata était spécifique de la L-asparagine, n’hydrolysait pas la D-asparagine et n’était pas spécifique de la L-glutamine.

Les paramètres cinétiques, Km et Vmax de l’enzyme purifiée, étaient respectivement de 6,72 mm d’asparagine et de 0,16 µM d’ammoniac/mL (Figure 4). Des valeurs de Km similaires de 6,6 et 7,0 mM ont été déterminées pour les asparaginases de L. arboreus et L. angustifolius, respectivement. L’asparaginase des graines de Lupinus a un Km élevé pour l’asparagine (12,2 mM). Km bas (1.2 mM) ont été déterminés pour l’asparaginase de V. unguiculata. Pour les bactéries, les valeurs de Km pour la L-asparaginase d’Escherichia coli et d’Erwinia carotovora étaient respectivement de 3,5 et 7,14 mM.

Figure 4

Tracé de Lineweaver-Burk reliant l’asparaginase I des vitesses de P. vulgaris à différentes concentrations de L-asparagine.

L’asparaginase I présentait un pH optimal à 8,0 (Figure 5). Entre pH 6,0 et 9,0, plus de 50% de son activité a été conservée. Bien que l’activité maximale à pH physiologique soit l’une des conditions préalables de la L-asparaginase pour l’activité antitumorale, l’enzyme purifiée serait utile car 80% de l’activité enzymatique était conservée à pH 7,5. L’enzyme a montré une stabilité au pH alcalin (pH 7,5–9,0) car elle a conservé 90% de son activité initiale lorsqu’elle a été incubée jusqu’à 24 h (Figure 6). Cependant, l’optimum de pH des L-asparaginases de plusieurs plantes variait de 8,0 à 8,5. La plupart des L-asparaginases de bactéries présentaient un pH alcalin optima (8,0-10).

Figure 5

pH optimal de l’asparaginase I de P. vulgaris. L’activité enzymatique a été mesurée à différents pH en utilisant la méthode de dosage standard décrite précédemment.

Figure 6

Stabilité du pH de l’asparaginase I de P. vulgaris à des pH différents après incubation pendant 24 h à 4°C.

On a constaté que l’asparaginase I avait une température optimale à 37 °C (figure 7). Un optimum de température similaire de l’asparaginase de V. unguiculata (40°C) a été rapporté. Cette température était également similaire à celle rapportée pour Pseudomonas aeruginosa et Pectobacterium carotovorum. L’activité optimale de Streptobacillus sp. l’asparaginase a été enregistrée à 35°C. Au contraire, la L-asparaginase des Chrombacteriaceae et Proteus vulgaris a été observée à 20 °C et 57°C, respectivement. Une relation non linéaire entre l’asparaginase I et la stabilité en température a été détectée (figure 8). L’activité enzymatique était stable jusqu’à 37°C après incubation pendant 1 h. Asparaginase de V. unguiculata était stable jusqu’à 40°C après incubation pendant 15 min. Les asparaginases de P. carotovorum et de C. annuum ont conservé leur activité initiale après incubation à 40°C et 45°C pendant 60 min, respectivement.

Figure 7

Optimum de température de l’asparaginase I de P. vulgaris. L’activité enzymatique a été mesurée à différentes températures en utilisant la méthode de dosage standard décrite précédemment.

Figure 8

Stabilité thermique de l’asparaginase I de P. vulgaris. Le mélange réactionnel a été préincubé à différentes températures pendant 60 min avant l’addition du substrat, puis refroidi dans un bain de glace. L’activité enzymatique a été mesurée à l’aide de la méthode de dosage standard décrite précédemment. L’activité à zéro heure a été considérée comme une activité à 100%.

L’effet de différents ions métalliques sur l’asparaginase I a été examiné (tableau 3). Les ions métalliques ont été utilisés à la concentration de 10 mM. K+ a pu augmenter considérablement l’activité de l’asparaginase I de 150%. Chez la plante, des asparaginases indépendantes de la K+ et dépendantes de la K+ ont été identifiées. K+ agit également comme activateur sur l’asparaginase de P. carotovorum. Ca2+ a légèrement augmenté l’activité de 110%, mais Cu2+ a légèrement inhibé l’activité de l’asparaginase I. De plus, Pb2+ et Hg2+ ont provoqué un effet partiellement inhibiteur sur l’asparaginase I. Cependant, l’asparaginase de V. unguiculata a été activée par Ni2+ et Co2+ et a été inhibée par Mn2+, Zn2+, Ba2+ et Hg2+. L’EDTA en tant qu’agent chélateur des métaux a provoqué un effet partiellement inhibiteur sur l’asparaginase I. Cependant, l’EDTA n’a eu aucun effet sur l’asparaginase de P. carotovorum.

4. Conclusions

La L-asparaginase I de P. vulgaris a été purifiée sous forme exempte de glutaminase, ce qui peut réduire la possibilité d’effets secondaires au cours du traitement anticancéreux. L’enzyme a montré une bonne stabilité dans une large gamme de conditions physiologiques telles que le pH et la température. Dans la prochaine étape de notre projet, la L-asparaginase I de P. vulgaris sera utilisée comme candidat potentiel pour le traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë.

Conflit d’intérêts

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts pertinent au présent document à divulguer.

Remerciements

Ce projet a été financé par le Plan National pour la Science, la Technologie et l’Innovation (MAARIFAH), Ville du Roi Abdulaziz pour la Science et la Technologie, Arabie Saoudite, prix no. (11-BIO-1516-03). Les auteurs remercient également l’Unité Scientifique et technologique de l’Université King Abdulaziz pour son soutien technique.