Test de kinase
Préparé par Swathi Arur
Protéine Kinase (solutions mères de kinases pures de 1 à 10 mg / ml) – pour ces tests, j’utilise de la kinase ERK2 purifiée (NEB). Pour chaque enzyme, il est important de déterminer le tampon optimal, la force ionique et le pH pour l’activité. Si ces conditions n’ont pas été établies, le protocole énuméré ci-dessous peut être utilisé comme point de départ.Substrat
(solution mère de 10 mM) – Les substrats contiennent généralement une sérine/thréonine dans un motif de site de phosphorylation. Comme témoin, j’utilise la protéine de base de la myéline (obtenue à partir de Sigma), qui a été utilisée par NEB pour calibrer la kinase ERK2.
De plus, les substrats doivent avoir une charge positive nette pour faciliter la liaison aux filtres à phosphocellulose utilisés dans le test. Pour la liaison quantitative au papier phosphocellulosique, il est recommandé d’avoir au moins 2 résidus basiques et une terminaison amino libre. Si un motif de site de phosphorylation n’est pas connu, un substrat général de tyrosine kinase peut être utilisé. Par exemple, la « protéine de base de la myéline » (est un substrat non spécifique pour de nombreux MAPK). Pour les réactions initiales, une concentration de substrat de 0,7 à 1,5 mM doit être utilisée. Pour déterminer les paramètres cinétiques de la phosphorylation du peptide synthétique, une gamme de concentrations de peptides est nécessaire
Tampon Kinase 10X – contient 5 mg / mL de BSA (pour empêcher l’adsorption de la kinase dans le tube de dosage), 150 mm Tris-Cl (pH 7,5).
ATP / MgCl2 (acheté auprès de Upstate Biotech – Cocktail Magnésium / ATP # 20-113) – une solution mère de 1 à 5 mM est pratique. Notez que la plupart des MAPK ont des valeurs Km pour l’ATP dans la plage 10-150 uM, donc pour les expériences cinétiques, il est important d’utiliser des concentrations saturantes d’ATP pour arriver à des valeurs de Km et Vmax pour les peptides.
ATP –10 mCi / mL.
Essais de kinases ERK2
a) ESSAI D’AUTORADIOGRAPHIE:
- Un dosage standard de kinase est réalisé dans un volume de 25 ul :
- 2,5 ul de tampon kinase 10X
- 5 ul de 1,0 mm MgCl2 / ATP (concentration finale de 0,2 mM)
- ATP (100-500 cpm / pmol)
- 3 ul de substrat de 10 mM (1.concentration finale de 2 mM)
- 1 U de la kinase ERK2
- H2O à 25 ul
1. Avant les expériences, préparez un cocktail contenant suffisamment de tampon, d’ATP et d’ATP pour compléter les dosages. Pour les dosages à différentes concentrations de substrat, le substrat doit être dilué et ajouté séparément à chaque tube. Après avoir distribué le cocktail dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml, placez les tubes dans un bain-marie à 30 degrés C pendant 30 minutes. Les réactions doivent être initiées par l’ajout de kinase et autorisées à se poursuivre à 30 degrés C.
2. Après le temps souhaité, terminez les réactions en ajoutant 2 X tampon d’échantillon SDS et épuisez-vous sur un gel.
3. Séchez le gel sur un papier Whatman 3.0, exposez le gel sec à un autoradiogramme et maintenez la cassette à -70c pendant 2 heures. (pour les expositions plus longues, assurez-vous que le film est à nouveau sec avant de mettre un nouvel autoradiogramme dessus).
b) ANALYSE CINÉTIQUE:
1. Effectuez le test de kinase comme ci-dessus, utilisez cette fois différentes concentrations des substrats à partir de 50 Nm à 1 mm. Arrêter la réaction après 30 minutes en ajoutant de l’acide trichloracétique (TCA) glacé à 10% (45 ul) à chaque réaction. Tourbillonner les réactions.
3. Tourner pendant 2 minutes en microcentrifugeuse (10K tr/min).
4. Repérez 35 ul des surnageants sur des cercles filtrants de phosphate de cellulose Whatman P81 de 2,1 cm de diamètre.
6. Laver les cercles filtrants P81 trois fois avec 500 ml d’acide phosphorique à 0,5% à froid (5 à 10 minutes par lavage). La progression des étapes de lavage peut être suivie en retirant le cercle de filtre P81 pour une réaction à blanc et en le vérifiant avec un compteur Geiger.
7. Laver une fois avec 200 ml d’acétone à température ambiante pendant 5 minutes.
8. Laisser sécher les cercles filtrants à température ambiante.
9. Mettez des cercles de filtre dans des flacons à scintillation et mesurez l’incorporation de 32P en comptant les tampons secs dans un compteur à scintillation. L’activité spécifique de l’ATP dans une réaction de kinase (par exemple, en cpm / pmol) peut être déterminée en repérant un petit échantillon (2-5 ul) de la réaction sur un cercle de filtre P81 et en comptant directement (pas de lavage). Les nombres par minute obtenus dans la réaction de kinase (moins le blanc) sont ensuite divisés par l’activité spécifique pour déterminer les moles de phosphate transférées dans la réaction.
Cinétique de Phosphorylation du Substrat
Les paramètres cinétiques de phosphorylation d’un substrat par un MAPK peuvent être déterminés à l’aide d’une variante du protocole ci-dessus.
1. Effectuer une réaction à une concentration élevée de substrat pour établir que la protéine est un substrat.
2. Variez la concentration enzymatique dans le test. Le taux de phosphorylation du substrat doit être proportionnel à la concentration enzymatique dans les conditions de l’essai. Cette expérience est également utilisée pour déterminer la quantité d’enzyme nécessaire aux études cinétiques.
Pour déterminer les taux, un cours temporel de phosphorylation du substrat doit être effectué. Dans ce cas, préparez une réaction enzymatique plus importante (nous utilisons 150 ul). Aux moments souhaités, prélever 25 ul aliquotes et les transférer dans des tubes de microcentrifugeuse contenant 45 ul de TCA glacé à 10%, et analyser les réactions telles que décrites ci-dessus. La phosphorylation du substrat doit être linéaire avec le temps, et pour la mesure des constantes cinétiques, les vitesses initiales de réaction (5%) doivent être utilisées.
3. Faire varier la concentration de substrat dans l’essai. Utilisez un graphique de la vitesse par rapport à la concentration en peptides pour obtenir une estimation initiale de la valeur de Km. Une large gamme de concentrations de substrat (par exemple, 20 uM à 2 mM) doit être utilisée pour cette mesure initiale.
4. Pour déterminer Km (substrat) et Vmax, faites varier la concentration en substrat et mesurez le taux de transfert de phosphate. Une bonne gamme de concentrations de substrat sont les multiples de Km suivants: 0,125 x Km, 0,25 x Km, 0,5 x Km, 1,0 x Km, 2,0 x Km, 4,0 x Km, 8,0 x Km. Les réactions doivent être effectuées en trois exemplaires pour de meilleurs résultats.
5. Les constantes cinétiques sont déterminées par des moindres carrés non linéaires pondérés adaptés à la vitesse hyperbolique par rapport aux tracés à l’aide de programmes itératifs tels que NFIT (Island Products, Galveston, TX).
CALCUL de RAR:
RAR: Rapport accepteur relatif = Vmax / Km défini comme une mesure globale de la capacité d’une protéine à fonctionner comme substrat.
Je normalise le RAR d’un substrat donné avec la Protéine Basique de Myéline, c’est-à-dire calcule la valeur de RAR pour chaque substrat puis la divise par la valeur de RAR de la Protéine Basique de Myéline (fixant ainsi MBP à 1,0).
