Les technologies de fluorescence sont la méthode préférée pour la détection, la détection analytique, le diagnostic médical, la biotechnologie, l’imagerie et l’expression génique depuis de nombreuses années. La fluorescence devient essentielle pour l’étude de processus moléculaires à haute spécificité et sensibilité à travers une variété de processus biologiques. Un problème important pour les applications pratiques de fluorescence est la non-linéarité apparente de l’intensité de fluorescence résultant des effets du filtre interne, de la diffusion des échantillons et de l’absorption des composants intrinsèques des échantillons biologiques. L’absorption de l’échantillon peut conduire à l’effet primaire de filtre interne (effet de filtre interne de type I) et est le premier facteur à prendre en compte. C’est un facteur relativement simple à contrôler dans toute expérience de fluorescence. Cependant, de nombreuses approches précédentes n’ont donné que des méthodes expérimentales approximatives pour corriger l’écart par rapport aux résultats attendus. Dans cette partie, nous discutons de l’origine de l’effet de filtre interne primaire et présentons une approche universelle pour corriger le signal d’intensité de fluorescence dans la gamme complète d’absorption. Fait important, nous présentons des résultats expérimentaux directs du fonctionnement de la correction. On considère les problèmes résultant de la variation de l’absorption à travers son spectre d’absorption pour tous les fluorophores. Nous utilisons la Rhodamine 800 et démontrons comment corriger correctement les spectres d’excitation dans une large gamme de longueurs d’onde. Deuxièmement, l’effet d’un absorbeur inerte atténue l’intensité du faisceau d’excitation lors de son passage dans la cuvette, ce qui entraîne une déviation significative des résultats observés. A titre d’exemple, nous présentons l’extinction par fluorescence d’un analogue du tryptophane, NATA, par l’acrylamide et nous montrons comment les résultats correctement corrigés se comparent aux résultats erronés initiaux. La procédure est générique et s’applique à de nombreuses autres applications telles que la détermination du rendement quantique, l’absorption tissulaire / sanguine ou l’absorption d’accepteurs dans les expériences de FRET.
