1. Test de mutation de l’exon KRAS 2 (codons 12/13) et de l’exon 3 (codon 61) : Test de mutation de Cobas® KRAS à usage diagnostique In Vitro (Roche).
Le test de mutation Cobas® KRAS est un test PCR en temps réel pour la détection qualitative de mutations somatiques dans l’exon 2 (codons 12/13) et l’exon 3 (codon 61) du gène KRAS en utilisant une entrée d’ADN de 100 ng. Le test peut détecter 19 mutations KRAS. La présence de mutations est détectée avec une spécificité analytique d’au moins 99% et une limite de détection d’au moins 5% de taux de mutants dans un fond d’ADN génomique de type sauvage.
Le test de mutation Cobas® KRAS est basé sur deux processus majeurs: (1) préparation manuelle d’échantillons pour obtenir de l’ADN génomique à partir d’une ou deux sections de 5 µm d’épaisseur de tissu FFPE CRC contenant au moins 10% de cellules tumorales; (2) amplification PCR de l’ADN cible à l’aide de paires d’amorces complémentaires et de deux sondes oligonucléotidiques marquées avec un colorant fluorescent. Les paires d’amorces utilisées définissent une séquence de 85 paires de bases pour l’exon 2 contenant les codons KRAS 12 et 13, et une séquence de 75 paires de bases pour l’exon 3 contenant le codon KRAS 61 dans l’ADN génomique humain. Une sonde est conçue pour détecter la séquence du codon KRAS 12/13 dans l’exon 2, et l’autre sonde est conçue pour détecter la séquence du codon KRAS 61 dans l’exon 3 du gène KRAS. La détection de mutation est réalisée par analyse de la courbe de fusion par l’analyseur Cobas z 480 (1).
2. Test de mutation KRAS v2 (LSR)
Le Test de mutation KRAS v2 (LSR) est un test PCR en temps réel spécifique à l’allèle pour la détection qualitative et l’identification des mutations des exons 2, 3 et 4 dans le gène de l’homologue d’oncogène viral du sarcome de rat Kirsten V-Ki-ras2 (KRAS) à partir de tissus fixés au formol et incorporés à la paraffine (FFPET). Le test est conçu pour détecter 28 mutations uniques. La présence de mutations est détectée avec une spécificité analytique d’au moins 99% et une limite de détection d’au moins 1% de taux de mutants dans un fond d’ADN génomique de type sauvage.
Le test de mutation KRAS v2 (LSR) est basé sur deux processus: (1) préparation manuelle d’échantillons pour obtenir de l’ADN génomique à partir de FFPET; et (2) amplification et détection par PCR de l’ADN cible à l’aide de paires d’amorces complémentaires et de sondes oligonucléotidiques marquées avec des colorants fluorescents.
Le test de mutation KRAS v2 (LSR) utilise des amorces qui définissent des séquences de paires de bases spécifiques pour chacune des mutations ciblées. L’amplification se produit uniquement dans les régions du gène KRAS entre les amorces; le gène entier n’est pas amplifié. Les séquences KRAS ciblées vont de 79 à 114 paires de bases. La détection des mutations est réalisée par analyse PCR avec l’analyseur Cobas z 480. (1)
3. Test de mutation BRAF/ NRAS (LSR)
Le Test de mutation BRAF / NRAS (LSR) est un test PCR en temps réel spécifique à l’allèle pour la détection qualitative et l’identification des mutations des exons 11 et 15 dans le gène proto-oncogène B-Raf (BRAF) et des mutations des exons 2, 3 et 4 dans le gène de l’homologue oncogène viral du neuroblastome RAS (NRAS) à partir de tissus fixés au formol et incorporés à la paraffine (FFPET) .
Le test est conçu pour détecter 36 mutations uniques. La présence de mutations est détectée avec une spécificité analytique d’au moins 99% et une limite de détection d’au moins 5% de taux de mutants dans un fond d’ADN génomique de type sauvage.
Le test de mutation BRAF/ NRAS (LSR) est basé sur deux processus principaux: (1) préparation manuelle d’échantillons pour obtenir de l’ADN génomique à partir de FFPET; et (2) amplification et détection par PCR de l’ADN cible à l’aide de paires d’amorces complémentaires et de sondes oligonucléotidiques marquées avec des colorants fluorescents.
Le test de mutation BRAF/NRAS (LSR) utilise des amorces qui définissent des séquences de paires de bases spécifiques pour chacune des mutations ciblées. L’amplification se produit uniquement dans les régions des gènes BRAF ou NRAS entre les amorces; le gène entier n’est pas amplifié. Les séquences BRAF vont de 101 à 120 paires de bases. Les séquences des ARN vont de 94 à 121 paires de bases. La détection des mutations est réalisée par analyse PCR avec l’analyseur Cobas z 480. (2)
Implication clinique
Les KRAS et les ARN sont des membres de la famille des oncogènes RAS étroitement liés, et des mutations dans l’un ou l’autre des gènes au niveau des codons 12, 13 (exon 2), du codon 61 (exon 3) et du codon 146 (exon 4) entraînent une augmentation des niveaux de protéines RAS liées à la guanosine triphosphate. La signalisation RAS hyperactive favorise l’oncogenèse. Dans le carcinome colorectal (CRC), des mutations KRAS et NRAS au niveau de ces codons sont trouvées dans jusqu’à 50% des cas et prédisent une absence de réponse au traitement anti-EGFR. La plupart des mutations RAS sont des mutations ponctuelles survenant dans l’exon KRAS 2 (codons 12 ou 13 ; environ 40%). D’autres mutations RAS sont moins fréquentes, les mutations les plus courantes se produisant dans les exons KRAS 3 et 4 et les exons NRAS 2 et 3 (3).
Environ 50% des mélanomes présentent des mutations activatrices dans le BRAF. Plus de 90% des mutations BRAF entraînent un changement du nucléotide 1799 T > conduisant à une substitution de la valine à l’acide glutamique en position 600 (V600E). La mutation BRAF V600E provoque une signalisation incontrôlée de la voie MAPK conduisant à une croissance et une prolifération cellulaires excessives. Les agents ciblant le BRAF mutant activé (inhibiteurs du BRAF) se sont avérés efficaces chez les patients atteints de mélanome métastatique porteur de cette mutation (1-3).
Outre sa valeur prédictive dans le mélanome, la mutation BRAF V600E a également une valeur pronostique dans le cancer colorectal et dans le cancer du poumon (CPNPC) (4,5,7). La mutation BRAF V600E est présente dans environ 10 % des carcinomes colorectaux métastatiques et a été associée à la présence d’instabilité des microsatellites (6). Dans l’ensemble, les patients atteints de CRC mutant BRAF ont un faible taux de réponse aux traitements conventionnels et un pronostic défavorable. Alors que les mélanomes mutés par le BRAF V600 sont sensibles aux inhibiteurs du BRAF, les CRC mutés par le BRAF V600 peuvent ne pas être aussi sensibles. L’activation de l’EGFR dans le cancer colorectal pourrait expliquer pourquoi les cancers colorectaux ont généralement une réponse plus faible aux inhibiteurs du BRAF. Par conséquent, il est conseillé d’initier un traitement d’association avec des inhibiteurs de l’EGFR et du BRAF.
La mutation BRAF V600E est également présente dans 3 à 5 % de tous les cancers du poumon (7). Alors que les inhibiteurs du BRAF se sont avérés efficaces chez les patients atteints de CPNPC à mutation V600E, la FDA a approuvé l’utilisation de la thérapie d’association avec un inhibiteur du BRAF et du MEK pour les patients atteints de CPNPC avec une mutation V600E sur la base des résultats d’un essai international, multicentrique, à trois cohortes, non randomisé, non comparatif, en ouvert, chez des patients atteints de CPNPC métastatique à mutation V600E localement confirmée.
Exigences relatives aux échantillons
Les échantillons acceptables pour l’essai sont des échantillons de tissus de carcinome colorectal fixés au formol et incorporés à la paraffine avec un temps de fixation de 6 à 48 heures.
Volume
1 bloc de paraffine représentatif est préféré. Alternativement, pour les échantillons de résection, un minimum de 5 sections de tissu non colorées (5 µm d’épaisseur) est requis (test RAS complet).
Instructions de stockage et d’expédition
Maintenir et expédier les échantillons à température ambiante.
Limitations
Une teneur tumorale insuffisante peut ne pas permettre la détection de mutations KRAS / NRAS / BRAF: 10% des cellules tumorales sont nécessaires. Le contenu tumoral est évalué avant l’analyse et la macrodissection est effectuée. Des fixatifs autres que le formol ou un temps de fixation prolongé peuvent donner des résultats inadéquats.
Exigences particulières
Aucune.
Délai d’exécution
5 à 7 jours ouvrables pour respectivement les lames et les blocs de paraffine.
- Li et coll. Un test Hautement vérifié pour la Détection de la mutation KRAS dans les tissus et le plasma du Cancer du Poumon, Colorectal et du Pancréas. Arch Pathol Lab Med. 2019 Fév;143:183-9
- Patten et coll. Un test sensible et précis pour la détection simultanée de 36 mutations BRAF et NRAS. Journal d’Oncologie Clinique 2018 36:15
- Douillard JY et coll. Traitement par Panitumumab-FOLFOX4 et mutations RAS dans le cancer colorectal. En anglais J Med. 2013 12 septembre; 369 (11): 1023-34.
Mis à jour le 03 décembre 2019
