- absztrakt
- 1. Bevezetés
- 2. Anyagok és reagensek
- 2.1. Humán limbális hámsejtek izolálása és tenyésztése
- 2.2. Kolóniaképző hatékonysági vizsgálat (CFE)
- 2.3. A sejtpopuláció megduplázódásának vizsgálata
- 2.4. RNS extrakció és Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció
- 2.5. Immunfluoreszcens festés
- 2.6. Western Blot analízis
- 2.7. Statisztika
- 3. Eredmények
- 3.1. A szaruhártya epitheliális őssejtek fenotípusa Sr táptalajban
- 3.2. CFE vizsgálat
- 3.3. PCR és valós idejű PCR analízis
- 3.4. Immunfluoreszcens festés
- 3.5. Western Blot
- 4. Megbeszélés
- versengő érdekek
- Köszönetnyilvánítás
absztrakt
a limbális hámsejtek lehet tartani a 3T3 feeder réteg magzati szarvasmarha szérum kiegészített táptalaj, és ezek a sejtek már sikeresen kezelésére használják limbális őssejt-hiány. A magzati szarvasmarha szérum azonban ismeretlen összetevőket tartalmaz, és mennyiségi és minőségi tétel-tétel eltéréseket mutat. A tenyésztési állapot javítása érdekében a meghatározott KnockOut szérumpótlást vizsgáltuk a magzati szarvasmarha-szérum helyettesítésére az emberi limbális hámsejt tenyésztésére. Humán primer limbális hámsejteket KnockOut szérumban, illetve magzati szarvasmarha szérummal kiegészített táptalajban tenyésztettünk. A sejtnövekedési sebességet, a génexpressziót és a limbális hámsejtek fenntartását tanulmányozták és összehasonlították e két csoport között. Humán primer limbális hámsejteket izoláltunk és sikeresen tenyésztettünk ebben az új KnockOut szérummal kiegészített táptalajban; a sejtproliferáció és az őssejtfenntartás hasonló volt a magzati szarvasmarha szérummal kiegészített táptalajban termesztett sejtekéhez. Ezek az adatok arra utalnak, hogy ez a KnockOut szérummal kiegészített táptalaj hatékonyan helyettesíti a hagyományos magzati szarvasmarha szérummal kiegészített táptalajt a limbális hámsejt-tenyésztéshez, és ez a táptalaj nagy potenciállal rendelkezik a limbális hámsejtek hosszú távú fenntartásában, a limbális hámsejtek őssejt-átültetésében és a szövetek regenerálásában.
1. Bevezetés
a szaruhártya epitheliális őssejtjei a limbus bazális rétegében helyezkednek el, amely a Vogt palisades nevű hullámos és pigmentált szerkezet . Ezek az őssejtek fenntartják a szaruhártya epitheliumának folyamatos megújulását egy életen át, és helyettesítik a sérült vagy elveszett szaruhártya hámsejteket . A limbális őssejt-hiány (LSCD) és a kapcsolódó szemfelszíni betegségek sikeresen kezelhetők tenyésztett limbális epithelialis autograft alkalmazásával . Ezeknek a műtéti kezeléseknek a sikere a limbális hámsejtek hatékony expanziójától függ, amely a legtöbb esetben 3T3 feeder réteget és magzati szarvasmarha szérumot (FBS) tartalmazott. A 3T3 feeder rétegkultúra rendszert Rheinwald és Green hozta létre, és sikeresen alkalmazták az emberi bőr, a szőrtüsző, a limbus, a kötőhártya és a szájnyálkahártya szöveteinek hámsejtjeinek kiterjesztésére . Az FBS azonban nem jól definiált, és mindig mennyiségi és minőségi tétel-tétel eltéréseket mutat . Az FBS potenciálisan káros xenogén komponenseket is tartalmaz, amelyek stimulálhatják az immunológiai reakciókat, és átadhatják az állatbetegségeket és kórokozókat . Mindezen aggályok mellett egyre nagyobb szükség van jól meghatározott táptalaj kifejlesztésére a hagyományos FBS-vel kiegészített táptalaj helyettesítésére.
Jelenleg léteznek bizonyos szérummentes alternatív táptalajok a hámsejtek növekedésére, mint például a meghatározott keratinocita szérummentes táptalaj (ksfm), keratinocita növekedési táptalaj (kgm), clontech (USA), Epilife (Invitrogen (USA) és progenitor sejt célzott (PCT) táptalaj (CellnTEC (Svájc)). Kimutatták, hogy ezek a termékek támogatják a szaruhártya hámsejtjeinek tágulását. Még mindig szükségük van meghatározatlan termékek kiegészítésére, például szarvasmarha-hipofízis kivonatra (BPE) vagy humán szérum albuminra (HAS). Ezen táptalajok többsége magas sejtvetési sűrűséget igényel, ami nem biztos, hogy praktikus az emberi szaruhártya hámsejtjeinek terjeszkedéséhez. Ezenkívül a szaruhártya hámsejtjei, amelyeket holoklonként detektálnak a 3T3 tenyésztési rendszerben, nem tarthatók fenn ebben a szérummentes táptalajban hosszú távon . A mai napig nincs meghatározott szérummentes táptalaj, amely hosszú távon támogathatja a szaruhártya epiteliális őssejtjeinek tágulását.
a KnockOut szérumpótlás (Sr) egy meghatározott szérummentes készítmény, amelyet úgy terveztek, hogy közvetlenül helyettesítse az FBS-t az embrionális őssejtek (Esc) és az indukált pluripotens őssejtek (IPSC) fenntartása érdekében. Kimutatták, hogy a KnockOut SR következetes növekedési feltételeket biztosít az ES-sejt és az iPSC tenyészet számára, és a KnockOut SR-vel kiegészített táptalajban termesztett ES sejtek lényegesen kevésbé differenciáltak, mint az FBS-vel kiegészített táptalajban termesztett sejtek, és a csíravonal átvitele a legkevésbé sem sérül. Tekintettel a hasonlóságokra a hámsejtek és az ES sejtek tenyésztési módszereiben, valamint annak fényében, hogy a KnockOut SR helyettesíti az FBS-t az ES sejttenyészetben, itt feltételezik, hogy a KnockOut SR felhasználható az FBS helyettesítésére a limbális hámsejt-tenyészetben.
2. Anyagok és reagensek
sejttenyésztési edényeket, lombikokat, centrifugacsöveket és szerológiai pipettákat vásároltak a Becton Dickinson-tól (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbecco módosított Eagle táptalaja (DMEM), Ham F-12, HEPES, penicillin és sztreptomicin, L-glutamin, 0,05% tripszin-0.A 02% – os EDTA oldatot, a Superscript III kit-et és az RNeasy-t az Invitrogen-GIBCO BRL-től szerezték be (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). A magzati szarvasmarha szérumot (FBS) a Hyclone-tól vásárolták (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). Az egér NIH 3T3 fibroblasztjait (ATCC CCL 92) amerikai típusú tenyésztési gyűjteményből nyertük (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). A Dispase II Roche-ból származott. Az ABCG2 (BXP-21 klón) és a connexin 43 elleni monoklonális antitest (MAB) Millipore-ból származik; a p63 (4A4 klón), a K5 és a K19 Santa Cruzból származik; a K3 mAb (ae5 klón) az ICN Pharmaceuticals-tól származik (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Alexa Fluor 568 – konjugált kecske anti-egér másodlagos antitest Invitrogen-GIBCO BRL-ből származott (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). A GeneAmp RNS-PCR és a Taqman Universal PCR Master Mix Amperáz UNG készletek az Applied Biosystems-től származnak (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). A mitomicin C, a szarvasmarha inzulin, a humán transzferrin, a hidrokortizon, a humán epidermális növekedési faktor (EGF), a kolera toxin és más reagensek a Sigma-Aldrich-től (St. Louis; http://www.sigmaaldrich.com/) származtak.
2.1. Humán limbális hámsejtek izolálása és tenyésztése
a szaruhártya-limbális gyűrűket öt egészséges donortól gyűjtötték be közvetlenül a szaruhártya-transzplantáció után, tájékozott beleegyezést kértek, és a minta betakarítási protokollját a Jilin Egyetem intézményi felülvizsgálati testülete (IRB) jóváhagyta. A friss szaruhártya-limbális gyűrűket 0,25%-os Dispase II-vel kezeltük egy éjszakán át, majd a hámréteget megtisztítottuk az alatta lévő stroma szövetből, és 0,05% – os tripszin-0,02% EDTA-val kezeltük 37 ^ C-on 15 percig. A tripszin aktivitást 10% FBS-sel semlegesítettük, majd a disszociált limbális hámsejteket összegyűjtöttük és 1500 fordulat / perc sebességgel 5 percig centrifugáltuk. A hámsejtek életképességét trypan blue-val határozták meg, kivéve a festést, és a sejtszámot hemocytométerrel számolták.
egér 3T3 fibroblasztokat tartottak fenn a Dulbecco módosított Eagle Táptalajában (DMEM, magas glükózszint) 10% FBS-szel, L-glutaminnal (2 mM) és penicillin-sztreptomicinnel (50 NE/mL) kiegészítve, és 5% CO2-vel és párásított atmoszférában tenyésztették. A 3T3 sejteket 6 naponta szubkulturáltuk, amikor elérte a 80-90% – os összefolyást. A 3T3 sejteket sorozatosan fenntartottuk, és csak a 20 áthaladás előtti sejteket használtuk a feeder réteg előkészítéséhez. A feeder réteg előkészítéséhez a összefolyó 3T3 sejteket mitomicin C-vel (10 Ft/mL) kezeltük 2 órán át 37 ft-on, kétszer PBS-sel mostuk, majd 0,05% – os tripszinnel kezeltük 5 percig 37 ft-on.3T3 a fibroblasztokat összegyűjtöttük és 30 000 sejt/cm2 sűrűséggel bevonjuk egy nappal a hámsejtek vetése előtt.
a humán limbális hámsejteket 3T3 feeder rétegen tenyésztettük FAD táptalaj vagy szérumpótló (SR) táptalaj alkalmazásával. A fad táptalaj a DMEM és a Ham F-12 táptalajának (1 : 1) keveréke, amely 10% magzati szarvasmarha szérumot, L-glutamint (2 mM) és penicillin-sztreptomicint (50 NE/mL), epidermális növekedési faktort (10 ng/mL), inzulint (5 db/ml), adenint (0,18 mM), hidrokortizont (0,4 db/mL), koleratoxint (0,1 nM) és trijódtironint (2 db) tartalmaz. Az SR táptalaj a DMEM és a Ham F-12 táptalajának (1 : 1) keveréke, amely 10% KnockOut SR szérumpótlást, L-glutamint (2 mM) és penicillin-sztreptomicint (50 NE/mL), epidermális növekedési faktort (10 ng/mL), inzulint (5 KB/mL), adenint (0,18 mM), hidrokortizont (0) tartalmaz.4 6G/mL), koleratoxin (0,1 nM), trijódtironin (2 nM), transzferrin (5 g/mL) és szelén (5 ng / mL). A limbális hámsejteket 3T3 feeder rétegre vetettük be 6000 sejt/cm2 sűrűséggel, és 5% CO2-vel és párásított atmoszférával tenyésztettük. A FAD közeget 3 naponta, míg az SR közeget 2 naponta cserélték.
2.2. Kolóniaképző hatékonysági vizsgálat (CFE)
a CFE vizsgálathoz FAD vagy SR tenyészetből származó 200 humán limbális hámsejtet vontunk be 100 mm-es petri-csészébe, amely mitomicin C-vel kezelt 3T3 feeder réteget tartalmazott,és a fent leírtak szerint tenyésztettük. 12 napos tenyésztés után az edényeket 10% formalinnal rögzítettük 30 percig szobahőmérsékleten, majd 1% rodamin B-vel festettük további 30 percig. Desztillált vízzel történő mosás után a telepszámokat megszámoltuk és elemeztük. A kolóniaképző hatékonyságot a képződött kolóniák számának elosztásával fejeztük ki 200-zal.
2.3. A sejtpopuláció megduplázódásának vizsgálata
a limbális hámsejteket mitomicin C-vel kezelt 3T3 feeder rétegen tartottuk FAD táptalaj vagy SR táptalaj alkalmazásával. A hámsejteket 80-90% – os összefolyás elérésekor tripszinizáltuk, és 6000 sejt/cm2 sűrűség mellett passzíroztuk. A kultúrákat sorozatosan fenntartották 10 átjárók. Minden egyes áthaladásnál a limbális hámsejteket betakarították, és a sejtek számát megszámolták. A népesség duplázásának (PD) számát az egyes szakaszokra A következő képlet szerint számítottuk ki: , ahol az egyes átjáróknál kapott cellák teljes számát, az elején pedig a galvanizáló cellák számát jelöli.
2.4. RNS extrakció és Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció
a limbális hámsejtek génexpressziós szintjének értékeléséhez PCR-t és valós idejű PCR-t végeztünk. A teljes RNS-t a szaruhártya hámsejtjeiből extraháltuk az RNeasy készlet segítségével, a gyártó utasításait követve. Az RNS-t 260 nm-en való abszorpciójával számszerűsítettük, és -80 kb-on tároltuk. A cDNS-ek szintetizálásához 1 db teljes RNS-t használtunk a felső index III reverz transzkripciós készlettel. A PCR-t Platinum PCR master mix (Life technológia) alkalmazásával, a valós idejű PCR-t pedig a SYBR Green PCR Master Mix (Roche) alkalmazásával, a korábban leírt primerekkel végeztük . A valós idejű PCR-reakciókat három példányban hajtottuk végre, egy kezdeti aktiválási lépéssel 95C-n 3 percig, majd 45 ciklus következett: 95C-n 30 másodpercig, 60C-n 30 másodpercig, és 72C-n 40 másodpercig. A relatív génexpressziót a ciklus küszöbértékének (delta Ct), a gének értékeinek a gliceraldehidek-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) delta Ct értékéhez viszonyított különbségének normalizálásával számítottuk ki.
2.5. Immunfluoreszcens festés
az emberi limbális hámsejteket 3T3 feeder rétegű tenyészlemezekbe vetettük be FAD vagy SR táptalajban. Három nappal a vetés után a tenyészeteket 4% paraformaldehiddel vagy hideg acetonnal rögzítettük 4 kb 10 percig. Kétszeri PBS-sel történő mosás után a sejteket 5% kecske szérummal blokkoltuk PBS-ben 30 percig. A P63 (1 : 200, 4A4, Santa Cruz), az ABCG2 (1 : 30, BXP-21, Millipore), a K3 (1 : 400, Millipore) és a connexin 43 (1 : 1000, Millipore) elleni elsődleges antitesteket egy éjszakán át inkubáltuk a 4.oc-n. Alexa Fluor 568-konjugált másodlagos antitestet 1 órán át alkalmaztuk PBS-sel történő kétszeri mosás után. A sejtmagokat ezután a Hoechst 33342-vel (1 db g/mL PBS-ben) 20 percig ellenfestettük. 3-szoros PBS-sel történő mosás után a sejttenyészetet rögzítő közeggel (Vector Laboratories, Burlingame, CA) szereltük fel, majd fluoreszcens mikroszkóppal (BX50; Olympus, Tokió, Japán).
2.6. Western Blot analízis
a tenyésztett limbális hámsejteket RIPA pufferrel (10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% nátrium-dezoxikolát, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA és proteáz inhibitor koktél; Roche Diagnostics) lizáltuk jégen 30 percig. A fehérjekoncentrációt bicinchoninic acid (BCA) protein assay (Pierce, Rockford, IL) alkalmazásával határoztuk meg. A teljes sejtlizátumokat (40 6G) 12%-os gradiens SDS-PAGE gélben elektroforézist végeztünk, nitrocellulóz membránba (Bio-Rad) helyeztük át, 5% fölözött tejjel blokkoltuk trisz-pufferolt sóoldatban (TBS) 1 órán át, és egér antitestekkel próbáltuk a proliferáló sejtmag antigén (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Millipore) vagy p63 (4A4, Santa Cruz, CA) ellen egy éjszakán át, 4 C. a membránokat ezután mossuk háromszor TBS-sel, kecske anti-egér IgG-vel (1 : 5000, HRP-konjugált, Santa Cruz, CA) vagy nyúl anti-kecske IgG-vel inkubálva (1 : 5000, HRP-konjugált, Santa Cruz, CA) 1 órán át szobahőmérsékleten, és fokozott kemilumineszcens szubsztrátokkal (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) fejlesztették ki. Az ABCG2, PCNA és p63 expressziós szintjét szemikvantitatívintenzitás méréssel mértük, és gapdh szintre normalizáltuk, amely belső kontrollként szolgált.
2.7. Statisztika
a CFE adatainak összefoglalása és a valós idejű PCR relatív szeresének jelentése: azt jelenti, hogy 6 SD, és összehasonlították a Student páratlan tesztjével a Microsoft Excel-rel (2003/XP verzió). A vizsgálati eredményeket Kétfarkú értékként jelentették, ahol statisztikailag szignifikánsnak tekintették.
3. Eredmények
3.1. A szaruhártya epitheliális őssejtek fenotípusa Sr táptalajban
összesen 5 szaruhártya-limbális gyűrűs szövetet gyűjtöttek be donoroktól a 32-65 éves korosztályban. Ezeket a szöveteket a betakarítást követő 24 órán belül tartósították és feldolgozták. Humán primer szaruhártya epitheliális sejttenyészet sikeres volt FAD táptalajon (1.a) és 1. B) ábra) és SR táptalajon(1. C) és 1. d) ábra) is. Az SR közepes + 3T3 feeder rétegben megtartott szaruhártya hámsejtek kis méretű és magas mag/citoplazma arányú morfológiát mutattak, ami tipikus differenciálatlan hámsejtek morfológiája volt, és a nagy differenciáló lapos laphámszerű sejteket ritkán figyelték meg(1 (c) ábra). Az SR táptalajban tartott hámsejtek a vetés után 3 nappal telepeket kezdtek kialakítani(1.ábra (c)). Ezeknek a telepeknek a mérete hasonló volt a fad medium + 3T3 adagolórétegben kialakult méretekhez (1.ábra(a)), de ezek a telepek kevésbé voltak szorosan tömörítve, mint a FAD + 3T3 adagolórétegben. 7 napon belül a hámsejtek egyenletes kis méretű SR táptalajban értek el összefolyást (1.ábra(d)), amelyet a FAD tenyészetben is megfigyeltek (1. ábra(b)). Ebben a vizsgálatban humán szaruhártya hámsejteket lehetett levezetni és fenntartani SR közepes + 3T3 feeder rétegben mind az öt donor esetében. Hosszú távú tenyésztéshez az emberi szaruhártya hámsejtjeit sorozatosan szubkultúráltuk SR közepes + 3T3 feeder rétegben több mint 10 átjárón (). Minden egyes áthaladás során a sejteket tripszinizáltuk és összegyűjtöttük, amikor a sejtek elérték a 80-90% – os összefolyást; a sejtek számát A populáció megduplázódásának vizsgálatához számítottuk ki. Az eredmény azt mutatja, hogy az SR táptalajból származó hámsejtek hozama közel van a FAD táptalajban tenyésztett sejtekéhez, amint azt a 2 .a) ábra mutatja, és ezek az adatok hasonlóak a korábbi Jelentésekhez. Összefoglalva, az itt bemutatott adatok azt mutatják, hogy az SR táptalaj + mitomicin C-vel kezelt 3T3 feeder réteg támogatja az emberi szaruhártya hámsejtek klonális növekedését és proliferációját.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. CFE vizsgálat
ezután megvizsgáltuk és összehasonlítottuk a fad és SR közegben tenyésztett szaruhártya hámsejtek CFE-jét. A CFE elemzéséhez az SR és FAD közegben tenyésztett szaruhártya hámsejteket betakarítottuk és 200 sejt / 100 mm-es petri-csészében vetettük be, amelyet mitomicin C-vel kezelt 3T3 feeder réteggel írtunk elő, és ezt a tenyészetet 12 napig hagytuk növekedni. A szaruhártya hámsejtjei a tenyésztés megkezdése után 5-7 nappal kezdtek kolóniákat képezni. Amint azt a 2. b) ábra mutatja, 12 napos tenyésztés után az SR táptalajban tartott szaruhártya hámsejtek hasonló CFE-t és kolóniaméretet mutattak, mint a fad táptalajban tartott sejtek. Az epiteliális sejtek CFE-értéke SR és FAD közegben volt, illetve (2.C) ábra). A statisztikai elemzés kimutatta, hogy nem volt szignifikáns különbség a kolóniaképző hatékonyság () és a kolóniák átlagos területe () között az SR és a fad táptalaj között (2(c) ábra). Számszerűsítettük a kolóniatípusok százalékos arányát a kolóniák területe alapján. Az eredmények azt mutatták, hogy az SR közegben képződött abortív telepek (kolónia területe <1 mm2) százalékos aránya hasonló volt a FAD közegben (). Hasonlóképpen, az SR táptalajban képződött nagy telepek (telepterület >4 mm2) százalékos aránya közel volt a FAD táptalajhoz () (2(d) ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az SR táptalajban tenyésztett szaruhártya hámsejtek hasonló magasabb fokú proliferációs potenciállal rendelkeznek, mint a fad táptalajban termesztett sejtek.
3.3. PCR és valós idejű PCR analízis
a génexpresszió vizsgálatához PCR-t és valós idejű PCR-t végeztek mind fad, mind SR közegben tenyésztett hámsejteken. Háztartási gén GAPDH használták, mint egy belső kontroll. A PCR-adatok azt mutatják, hogy mind a FAD, mind az SR táptalajban tenyésztett sejt a proliferatív marker PCNA magas szintű transzkriptum expresszióját mutatja. A sejtek mindkét táptalajban a citokeratin 3 és a citokeratin 12 pozitív expresszióját mutatják, ami összhangban van limbus eredetükkel. A bazális réteg hámsejt marker, a citokeratin 15 pozitív expresszióját szintén megfigyelték mindkét tenyészetben. Mindkét tenyészetben kimutatták az ABCG2 és a ons 63 expressziót, bár az SR táptalajon végzett elsődleges tenyésztés után az ABCG2 expresszió kismértékben csökkent. A connexin 43 expressziójának alacsony szintjét mindkét tenyészetben megfigyelték, és a hámsejtek differenciálódásának alacsony szintjét mindkét közegben megfigyelték. A valós idejű PCR esetében az mRNS-szint kvantitatív analízise azt mutatta, hogy a p63 és az ABCG2 expressziójában nem volt szignifikáns különbség () a fad és az SR közegben tenyésztett hámsejtek között (4(a) ábra). A cornea epithelialis differenciálódási marker citokeratin 3 és citokeratin 12 valós idejű analízisét is elvégezték. Mindkét marker alig volt kimutatható mind a FAD, mind az SR sejtkultúrákban, és meglepő módon nincs szignifikáns különbség () az expresszió szintjén a két kultúra között.
3.4. Immunfluoreszcens festés
annak igazolására, hogy az SR táptalajban tenyésztett hámsejtek megtartották a szárat és a differenciálatlan állapotot, számos proliferációs, differenciálódási és feltételezett epitheliális őssejt markernek immunfluoreszcens festését végeztük. Amint az A 4. ábrán látható, az SR táptalajban a legtöbb hámsejt kis és egységes morfológiát mutatott, és a legtöbb sejtet erősen festették p63-mal, a feltételezett epitheliális őssejt markerrel. ABCG2 pozitív festett sejteket is megfigyeltek a limbális hámsejt-kolóniákon belüli foltos eloszlásban. Az SR táptalajban tartott sejtek gyengén festettek a connexin 43 és a citokeratin 3 szempontjából. E két differenciálódási marker alacsony expressziója arra utal, hogy a hámsejtek differenciálódása alacsony a sejttenyészetben. Hasonló festési stílust figyeltek meg a fad táptalajjal fenntartott sejtekben is (4(b) ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az SR táptalajban tenyésztett humán limbális hámsejtek fenntartották a feltételezett hámsejt-markerek magas szintű expresszióját, miközben alacsony differenciálódási markereket fejez ki.
3.5. Western Blot
a kvantitatív génexpresszió és az immunfluoreszcens festési eredmények kettős megerősítéséhez a potenciális epitheliális őssejtek markereinek (p63 és ABCG2) és proliferációs markereinek (PCNA) expresszióját western blot alkalmazásával értékeltük. Monoklonális p63 antitest (4A4 klón, Santa Cruz) alkalmazásával a p63 proteint (70 KD, Enterprises) magas expressziós szinten detektáltuk SR közegben. Az ABCG2 (70 KD) expresszióját az SR közegben tenyésztett sejtek minden egyes áthaladásában detektáltuk. PCNA-t, proliferációs markert is kimutattunk SR táptalajon tenyésztett sejtekben(3 (c) ábra). A P63, az ABCG2 és a PCNA expressziós szintje 10 szakaszban hasonló volt, szemikvantitatív intenzitásméréssel(3 (d) ábra), gapdh-t használva belső kontrollként.
(a)
(b)
(c)
(d)
a)
b)
c)
d)
(a)
(b)
(a)
(b)
4. Megbeszélés
a 3T3 feeder rétegen tenyésztett hámsejteket sikeresen levezetették és különböző klinikai helyzetek kezelésére használták, mint például súlyos égési sérülések, diabéteszes lábfekélyek, bőrhibák és szájnyálkahártya-hibák . A limbális hámsejtek első transzplantációját 1997-ben írta le Pellegrini et al. . Az elmúlt évtizedekben számos különböző tenyésztési módszert fejlesztettek ki , beleértve a limbális hámsejtek tenyésztését emberi amnion membránon (HAM) 3T3 adagolóréteggel vagy anélkül , hámsejtek tenyésztése hőmérsékletre reagáló lemezeken, valamint hámsejtek tenyésztése kereskedelmi szérummentes táptalajjal. Mivel a legutóbbi jelentés azt jelzi, hogy a szaruhártya/limbus hámsejtek transzplantációjának klinikai eredménye attól függ, hogy a limbális őssejtek megmaradnak-e a sejttenyészetben, rámutattak arra, hogy a holoklonok csak a fad + 3T3 tenyésztési rendszerben maradtak meg . Mivel ez a tenyésztési protokoll magában foglalja az FBS használatát, egyre növekvő biztonsági aggályok merülnek fel azzal kapcsolatban, hogy az FBS rosszul meghatározott állati termékek, és potenciálisan állati eredetű betegségeket terjeszthet a betegek számára . Ezért egyre nagyobb szükség van állati termékmentes és FBS-mentes táptalaj kifejlesztésére a hagyományos FAD táptalaj helyettesítésére .
ebben a tanulmányban kifejlesztettünk egy új szérummentes táptalajt, amelyben a KnockOut SR helyettesítette az FBS-t. A limbális hámsejtek fenotípusait ebben az új szérummentes táptalajban immunfestéssel értékelték a javasolt őssejt markerek (p63, ABCG2) és differenciálódási markerek (citokeratin 3, connexin 43) ellenanyagaival.
a P63 nukleáris transzkriptum faktort korábban az epitheliális őssejtek markerének javasolták, és ezekben a sejtekben a P63 izoformák domináns izoformája a 63. Eredményeink összhangban vannak a korábbi jelentésekkel; a nukleáris P63 erősen expresszálódott limbális sejttenyészetben, amit immunfestéssel, valós idejű PCR-rel és western blot-tal mutattak ki. A P63 jelenléte a limbális sejttenyészetben magas proliferációs és önmegújulási potenciálra utal. ABCG2, a ATP kötő kazetta (ABC) transzporterek, eredetileg emlőrák-rezisztens protein 1 (BCRP1) néven ismert, egy másik feltételezett őssejt-markerként javasolták felnőtt őssejtek, beleértve a limbus hámsejteket is őssejtek . Az ABCG2 magas expresszióját az SR táptalajban immunfestéssel és valós idejű PCR-rel igazolták.
a K3 és a K12 jól ismert szaruhártya-specifikus markerek . Az immunfestés és a valós idejű PCR eredmények következetesen azt mutatták, hogy a sejtek K3 és K12 negatívak voltak, megerősítve limbus eredetüket. A Connexin 43 a gap junction fehérjék családjának tagja; lehetővé teszi a kis molekulatömegű oldott anyagok közvetlen diffúzióját a szomszédos sejtek között. A Connexin 43-at differenciált hámsejtekkel expresszálták , és ezeknek az intercelluláris kommunikációs molekuláknak a hiánya az epitheliális őssejtek jellemzője lehet.
eredményeinkben a sejtek nagyobb százaléka expresszálta a p63-at és az ABCG2-t, míg kevés sejt expresszálja a K3/K12 és a CX43 differenciálódási markereket. Így az SR szérummentes táptalajban lévő humán limbális epitheliális őssejtek hasonló fenotípusokat mutattak és fenntartják a differenciálatlan állapotokat az FBS táptalajhoz képest.
összefoglalva, az FBS-t helyettesítő KnockOut SR alkalmazásával új szérummentes táptalajunk fenntartja az emberi szaruhártya hámsejtjeinek növekedését és proliferációját, és megőrzi az epitheliális őssejteket differenciálatlan fenotípusukban. Ez az új szérummentes tenyésztési módszer kiegészítésként definiált és viszonylag könnyen szabályozható. Nagy potenciállal rendelkezik a klinikai limbális hámsejt-transzplantációban és a szövetek regenerálásában.
versengő érdekek
a szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő érdekeik.
Köszönetnyilvánítás
ezt a munkát a Jilin Egyetem és a kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (NSFC 30500548) támogatta.
