a K48-kapcsolt Ub lánc proteaszomális receptor általi felismerésének szerkezeti alapja rpn13

a K48-kapcsolt Ub lánc dinamikusan ingadozik több konformáció között

smFRET-et használtunk a két Ub alegység térbeli elrendezésének felmérésére ligandummentes K48-diubban. A fluorofórokat, az Alexa Fluor 488-at és a Cy5-öt a disztális Ub N-terminálisánál és a proximális Ub C-terminálisánál vezettük be (kiegészítő ábra. S1a). Az elvárás maximalizálási algoritmus32 használatával a K48-diUb smFRET profilja legjobban három átfedő FRET fajként írható le (kiegészítő ábra. S2). A magas, közepes és alacsony FRET Fajok Központja a FRET hatékonyság 0,74, 0,57 és 0,23, a megfelelő populációk ~48, ~39 és ~13% (ábra. 1a). A fluoroforok középpontja közötti FRET távolságokat ~43, ~50, ~64-re számítjuk. Így a magas -, közepes-és alacsony-FRET Fajok kompakt, félig nyitott és nyitott állapotokhoz rendelhetők, amelyek a K48-diUb esetében már léteznek.

a fluorofórokkal konjugálva a proximális Ub 76 C helyén és a disztális Ub 0 C helyén (vö. Kiegészítő Ábra. S1a), az smFRET profil három átfedő FRET fajhoz illeszthető. Hacsak másként nem jelezzük, ezt a pár konjugációs helyet használják a K48-diUb összes smFRET-vizsgálatához. A magas FRET Fajok (piros színű) egy már létező kompakt állapotnak felelnek meg. b-d A kompakt állapot szelektíven dúsítható teljes hosszúságú Rpn13-Mal, a populáció növekedése pedig egy kötő izotermához illeszthető. e-g a kompakt állapot szelektíven dúsítható Rpn13NTD – vel, a populáció növekedése pedig kötelező izotermának tekinthető. h az n25c/N25C helyeken konjugált fluorofórokkal az Rpn13NTD szelektíven gazdagíthatja a K48-tetraUb disztális diubjának már létező kompakt állapotát(vö. Kiegészítő Ábra. S5), kötődési affinitást biztosítva. Az smFRET Fajok populációit három független mérés alapján átlagoljuk, a hibák 1 SD-t jeleznek; a KD-értékeket a legjobban illeszkedő ~ illesztési hibákként jelentik

a K48-diUb konformációs ingadozását korábban smFRET26 alkalmazásával vizsgálták. Ebben a tanulmányban a szerzők két smFRET fajt határoztak meg a K48-diUb esetében, nevezetesen a magas FRET és az alacsony FRET fajokat, amelyek középső FRET hatékonysága 0,69, illetve 0,41 volt, a nem FRET faj mellett. A szerzők kimutatták, hogy egy inaktivált OTUB1 (OTUB1i), a K48 izopeptid-kapcsolatra specifikus deubiquitináz titrálása33, főleg az alacsony FRET fajokat gazdagítja. Megfigyelésük arra a javaslatra vezetett, hogy a K48-diUb az OTUB1 által kifejezetten felismerhető egy konformációs szelekciós mechanizmuson keresztül. Itt megismételtük az smFRET titrálást, és megállapítottuk, hogy az OTUB1i gazdagítja a közepes FRET fajokat (kiegészítő ábra. S3a-c). Ezenkívül a közepes FRET Fajok populációs növekedése az OTUB1i titráláskor illeszthető egy kötő izotermához, amelynek KD értéke 7,7 0.1 .. m (kiegészítő ábra. S3d), amely közel áll a korábban bejelentett KD értékhez26. Így a jelen vizsgálatban szereplő közepes FRET fajoknak meg kell felelniük az előző vizsgálatban szereplő alacsony FRET fajoknak, és az eltérés az smFRET időnyomok különböző fotonszámlálási hatékonyságából és illesztési rutinjából eredhet.

annak további megerősítésére, hogy a K48-diUb három már létező konformációs állapot között ingadozik, fluorofórokat vezettünk be további fluorofor konjugációs helypárokon (kiegészítő ábra. S1b-d). Az alternatív helyszínek esetében, bár a FRET Fajok központi hatékonysága különbözik, az smFRET profilok továbbra is három átfedő FRET fajként írhatók le, hasonló populációkkal (kiegészítő ábra. S4). Például a 25 C/25 C konjugációs hely esetében a magas, közepes és alacsony FRET Fajok Központja a FRET hatékonyság 0,68, 0,54 és 0,21, a megfelelő populációk ~48%, ~43% és ~9% (kiegészítő ábra. S4d). Így a fluoroforok konjugációja nem valószínű, hogy megzavarja a fehérje szerkezetét, és az smFRET mérések felfedték a K48-diUb inherens konformációs dinamikáját, függetlenül a konjugációs helytől, vagyis a K48-diUb három különböző állapot között váltakozik partnerfehérje hiányában.

annak további felmérése érdekében, hogy a hosszabb K48-kapcsolt Ub láncban lévő Ub alegységek is ingadoznak-e több konformációs állapot között, elemeztük a K48-kapcsolt tetra-ubiquitin (K48-tetraUb) smFRET profilját. A fluorofórokat két N25C helyen konjugáltuk a disztális diubban (tiszteletben tartva a proximális diubot) K48-tetraUb. A smFRET Profil is illik, mint három egymást átfedő izgulj Fajok (kiegészítő ábra. S5a). Bár a három faj relatív populációi különböznek egy izolált K48-diubétól, ugyanazon helyeken konjugált fluoroforokkal (kiegészítő ábra. S4d), a FRET Fajok középső FRET hatékonysága szinte azonos. Így a diUb egység konformációs állapota valószínűleg hosszabb K48-kapcsolt Ub láncban megmarad, míg a relatív populációk különbsége a proximális diUb moduláló hatásának eredménye lehet.

a magas FRET fajokat szelektíven dúsítja az Rpn13

a K48-kapcsolt Ub lánc konformációs dinamikájának és az Rpn13 felismerés közötti kapcsolat felmérése érdekében 150 pM fluorofor-jelölt K48-diUb-ot titráltunk az emberi teljes hosszúságú Rpn13 fehérjével. Érdekes módon 100 nM rpn13 hozzáadásával a K48-diUb már létező nagy FRET fajai ~48%-ról ~57% – ra dúsulnak (ábra. 1a, b), míg a közepes és alacsony FRET Fajok populációja csökken. A magas FRET Fajok populációja tovább növekszik, több Rpn13 hozzáadásával (ábra. 1C), és a kötési izoterma 119 24 nm KD értékre illeszthető (ábra. 1d).

korábban kimutatták,hogy az Rpn13NTD elsősorban az Ub kötésért felelős6, 7. Így smFRET titrálást végeztünk 150 pM fluoroforral jelölt K48-diUb esetében, csak Rpn13NTD alkalmazásával, amely csak az első 150 maradékot tartalmazza. Az Rpn13NTD szelektíven gazdagítja a K48-diUb magas FRET fajait is (ábra. 1e, f). A magas FRET Fajok populációjának növekedése felszerelhető úgy, hogy a KD értéke 33,1 6,9 nm legyen (ábra. 1g), ami az affinitás körülbelül 4-szeres növekedését jelenti a teljes hosszúságú Rpn13-hoz képest. Ha a fluorofórok alternatív konjugációs helyeken kapcsolódnak (kiegészítő ábra. S1b és S4b), az Rpn13NTD titrálása hasonló tendenciát követve egyenértékű FRET Fajok dúsulását is eredményezi, majdnem azonos KD értéket biztosítva (kiegészítő ábra. S6). Így a megjelenés további szermaradékok lehet egy kis gátló hatása közötti kölcsönhatás Rpn13NTD és K48-diUb.

továbbá smFRET titrálást végeztünk 150 pM K48-tetraUb esetében a disztális diubnál konjugált fluoroforokkal (kiegészítő ábra. S5a). Az Rpn13NTD titrálása szelektíven gazdagítja a fluorofórral jelölt disztális diUb már létező nagy FRET fajait (kiegészítő ábra. S5b-d), és a kötési izoterma 214 60 nm KD értékre illeszthető (ábra. 1 óra). A kötési affinitás 7-szeres csökkenése az Rpn13NTD:K48-diUb interakcióhoz képest a distalis diUb és a proximális diUb34 közötti önszövetségnek tulajdonítható, így a kötési felület kevésbé áll rendelkezésre az Rpn13 kötéshez. Fontos, hogy a K48-diUb vagy a K48-tetraUb összes smFRET titrálása esetén a magas FRET Fajok középső hatékonysága alig változik Rpn13 vagy Rpn13NTD hiányában vagy jelenlétében. Ez azt jelenti, hogy az Rpn13 egy konformációs szelekciós mechanizmuson keresztül kötődik a K48-diUb már létező konformációjához, függetlenül attól, hogy a K48-diUb önmagában vagy hosszabb része Ub lánc. Ez azt is jelenti, hogy a magas FRET Fajok, azaz a K48-diUb már létező kompakt állapota nem teljesen zárt, és készen áll arra, hogy kölcsönhatásba lépjen más fehérjékkel. Fontos, hogy a nagy FRET Fajok szelektív dúsítása azt is jelzi, hogy az Rpn13-nak egyszerre kell kölcsönhatásba lépnie mindkét Ub alegységgel.

az Rpn13 előnyösen kötődik a K48-hoz kapcsolt diUb

az Rpn13 kötési specificitásának értékeléséhez a K48 kötésre vonatkozóan megvizsgáltuk az Rpn13 és más típusú Ub fehérjék közötti kötési affinitást. A 200 nM-es Rpn13NTD titrálásával 150 pM fluoroforral jelölt K48-diUb-ba a magas FRET Fajok populációja 15% – kal növekszik ~48% – ról ~63% – ra (ábra. 1f). Ennél a koncentrációnál a K48-diUb kötés még nem telített Rpn13NTD-vel (ábra. 1g), ezért a magas FRET Fajok populációja érzékeny a rendelkezésre álló Rpn13NTD koncentráció kis változására. A jelöletlen K48-diUb versenyezhet az Rpn13NTD-hez való kötődésért fluoroforral jelölt K48-diUb-tal. 150 pM jelöletlen K48-diUb hozzáadásával a magas FRET Fajok populációja 7,5%-kal csökken, ami az Rpn13NTD-hez kötött fluorofórral jelölt K48-diUb 50% – os gátlásának felel meg (ábra. 2a). 300 pM jelöletlen K48-diUb hozzáadásával a magas FRET Fajok populációja 11% – kal csökken, összesen 73% – os gátlást jelent (ábra. 2b). Mint ilyen, mind a fluoroforral jelölt, mind a címkézetlen K48-diUb ugyanazon kötési interfészért versenyez az Rpn13-on, hasonló kötési affinitással. Ez azt is jelenti, hogy a fluoroforok K48-diubhoz való konjugációja csekély zavart okoz az Rpn13NTD és a K48-diUb közötti kölcsönhatásban.

a, b 200 nM Rpn13ntd hozzáadása először gazdagítja a fluorofórral jelölt K48-diUb nagy FRET fajait(vö. 1F ábra), valamint a 150 pM és 300 pM jelöletlen K48-diUb további hozzáadása csökkenti a magas FRET Fajok populációját. c, d A 150 pM és 300 pM jelöletlen Ub monomer hozzáadása elhanyagolható hatást gyakorol a magas FRET Fajok populációjára. e, f A 150 pM K48-diUb és 150 pM M1-diUb hozzáadása a magas FRET Fajok populációjának nagyon kis csökkenését okozza

ezenkívül a 200 nM-es Rpn13NTD és a 150 pM-es fluorofor-jelölt K48-diUb keverékhez jelöletlen Ub monomert, K63-kapcsolt diubiquitint vagy M1-kapcsolt diubiquitint adtunk hozzá annak felmérésére, hogy más típusú Ub képes-e kiszorítani a K48-diubot. A magas FRET Fajok populációja alig változik 150 pM vagy 300 pM Ub monomer hozzáadásával (ábra. 2c, d). A 150 pM K63-diUb és 150 pM M1-diUb hozzáadásával a magas FRET Fajok populációja szintén változatlan a hibatartományon belül (ábra. 2e, f). Ezzel szemben az 1 db-os rpn13ntd közvetlen titrálása fluorofor-konjugált K63-diUb-ba és M1-diUb-ba kevés változást okoz a már létező smFRET profiljukban (kiegészítő ábra. S7). Az Rpn13NTD együtt szelektíven kölcsönhatásba lép a K48-diUb – tal.

megoldás szerkezete Rpn13NTD:K48-diUb komplex

bár most megmutattuk, hogy az Rpn13NTD szelektíven kölcsönhatásba lép a K48-diUb-mal,csak az rpn13ntd és az Ub monomer közötti komplex szerkezetet határoztuk meg6, 8. Annak megértése érdekében, hogy a K48-diUb két alegysége hogyan képes egyidejűleg kölcsönhatásba lépni az Rpn13NTD-vel, az rpn13ntd:K48-diUb komplex oldatszerkezetének meghatározását tűztük ki célul nukleáris mágneses rezonancia (NMR) alkalmazásával. A fehérjekomplex kialakulásakor a határfelületi maradványok eltérő helyi környezetet tapasztalnának, ezért NMR jeleket jelenítenének meg. Megállapítottuk, hogy a jelöletlen K48-diUb titrálása 15N-jelölt Rpn13-ra nagy kémiai eltolódási perturbációkat (CSP-ket) okoz, amelyek főként a 73-83 és a 93-106 maradványokat foglalják magukban (ábra. 3a). Ezek a maradékok egy összefüggő felületet képeznek az Rpn13-on, amely az rpn13ntd és az Ub monomer6,7 között korábban meghatározott komplex struktúrából várhatónál nagyobb területet fed le. Másrészről, címkézetlen Rpn13NTD titrálása K48-dUb – ra, proximális vagy disztális Ub 15N jelöléssel, a másik alegység pedig címkézés nélkül, a CSP-ket elsősorban a mindkét Ub alegység kontinense. A határfelületi maradványok egy része szintén eltűnt a komplex kialakulásakor (ábra. 3b, c).

az a-c CSP a gerinc amid protonok 1H és 15N dimenzióinak átlaga volt, amikor a komplex 0,2 mM-es izotóppal jelölt és címkézetlen fehérjékkel jött létre. Betétek: a 15N-vel jelölt alegységet felületi ábrázolással szemléltetjük, a piros színű maradványok CSP-jei pedig a szaggatott vonal felett vannak. d, e a disztális Ub E24C helyén konjugált paramágneses szondával a paramágneses és diamágneses spektrumok közötti intenzitási arányokat, valamint a pre-ons 2 értékeket a 15N-vel jelölt rpn13ntd gerinc amid protonjaira értékeltük. A szürke dobozok nagyon nagy intermolekuláris PREs maradványokat jeleztek. f a paramágneses szondával konjugálva a proximális Ub n25c helyén, a 15N-vel jelölt disztális Ub amid protonjaira a K48-diUb-ban mértük a 68-as értékeket. A hibasávok 1 SD-t jeleznek., a komplexumban teljesen kiszélesedett maradványokat csillagokkal jelöljük

a nukleáris Overhauser-effektus (NOE) az atommagok közötti távolságviszonyt (<6 ons) jelenti. Ezenkívül a 13C félig szűrt NMR kísérlet NOE-t biztosíthat a 12C-kötésű proton és a 13C-kötésű proton között, azaz intermolekuláris távolságkapcsolat. Intermolekuláris Noe-kat kaptunk az Rpn13NTD és a proximális Ub, az Rpn13NTD és a disztális Ub, valamint a proximális Ub és a disztális Ub között (kiegészítő ábra. S8). Továbbá konjugáltunk egy maleimid-EDTA-Mn2 + paramágneses szondát a disztális Ub E24C helyén, és összegyűjtöttük paramágneses relaxációs fokozás (PRE) az rpn13ntd gerinc amid protonjaihoz, a megállapított protokollt követve22,35. A paramágneses és a diamágneses spektrumok csúcsintenzitásának arányával vagy a transzverzális relaxációs fokozással (62) értékelve az Rpn13 30-42 és 101-106 maradványok nagy PREs-t tapasztalnak súlyos vonalszélesedéssel (ábra. 3d, e). A paramágneses szondát a proximális Ub n25c helyén is konjugáltuk,és értékeltük a disztális Ub keresztirányú relaxációs fokozási sebességét (distalis UB) (ábra). 3f). Nagy PRE-értékek figyelhetők meg a ligandummentes K48-diUb két Ub alegysége között, és az Rpn13NTD hozzáadása növeli az Inter-Ub PREs-t, de hasonló PRE-profillal. Az NMR előtti kísérletek tehát megerősítik, hogy az Rpn13NTD gazdagítja a K48-diUb már létező kompakt állapotát.

az Rpn13NTD finomításához:K48-diub komplex szerkezet a kísérleti korlátozásokkal szemben merev test dokkolást hajtottunk végre a diub linker maradványok és a határfelületi maradványok oldalláncai számára biztosított torziós szögszabadsággal. A 20 legalacsonyabb energiájú konformer esetében az összes merev maradék gerinc nehéz atomjainak gyökér-Közép-négyzet (RMS) eltérése 0,86 ~ 0,54 ~ (kiegészítő ábra. S9 és S1 táblázat). A K48-diUb két Ub alegysége továbbra is kapcsolatban áll a komplex, eltemető oldószerrel hozzáférhető felület (SASA) ~1130 62. Másrészt az Rpn13NTD beékelődik, eltemetve a Sasa ~940 a proximális Ub-vel, a Sasa ~1300 a disztális Ub-vel (ábra. 4a). Az rpn13ntd és a K48-diUb proximális UB közötti komplex szerkezet a jelen tanulmányban hasonló az rpn13ntd és az Ub monomer6,7 közötti ismert komplex szerkezethez, a gerinc nehéz atomjainak RMS különbsége 2,17 0,31 (kiegészítő ábra. S10a). Érdekes módon, bár az L8, I44 és V70 hidrofób maradványok a proximális Ub – ben részt vesznek az Rpn13 kölcsönhatásában, ugyanaz a három maradék a disztális Ub-ben az Ub-Ub interfészbe van eltemetve.

az Rpn13NTD szerkezete:K48-diUb komplex. A komplex kialakulása kiterjedt interfészeket temet el az alegységek között. b az rpn13ntd és a K48-diUb disztális Ub elektrosztatikus potenciálfelületei, a 3 kBT-skálán rajzolva. Az R104 maradványok az Rpn13NTD-ben és a D39 maradványok a disztális Ub-ben golyóként és botként jelennek meg. a C R104E töltés-visszafordító mutáció az rpn13ntd-ben a K48-diubhoz való kötődési affinitás 300-szoros csökkenését okozza, amint azt az smFRET értékelte (vö. Kiegészítő Ábra. S11). A KD értéket a legjobban illeszkedő illesztési hibákként jelentik. D Western blot elemzések azt mutatják, hogy az rpn13 r104e mutáns transzfekciója (N-terminális zászlóval) növeli a K48-hoz kapcsolt poliub fehérjék teljes mennyiségét a sejtben. e a sejtek életképessége hősokk esetén (a hősokk nélküli sejtekhez viszonyítva) azt mutatják, hogy az rpn13 r104e mutáns transzfekciója, de nem a wildtype Rpn13, termotoleranciát biztosít. * P < 0, 05, ***P < 0.001, hogy ellenőrizzék sejtek ugyanabban a csoportban, párosítatlan T-teszt; # # P < 0,01, ## # P < 0,001, a kezeletlen sejtek hősokk, egyirányú ANOVA; && P < 0.01, &&&P < 0,001, a wildtype Rpn13 transzfektált sejtek hősokk, egyirányú ANOVA

az Rpn13NTD: K48-diUb komplex szerkezetét egymolekulájú FRET adatokkal is megerősíthetjük. A komplex szerkezet alapján modelleztük a fluorofórokat konjugációs helyükön a K48-diUb – ban. Az átlagos távolság 43,2 6db.5.8 6db a fluorofór aromás gyűrűk geometriai középpontjai között, ami megfelel a 0,73 0,13-as elméleti FRET hatásfoknak (kiegészítő ábra. S10b). Ez az érték majdnem megegyezik a magas FRET fajoknál megfigyelt középső hatékonysággal (ábra. 1a).

az Rpn13NTD megzavarása: a disztális Ub kölcsönhatás az ubiquitinált fehérjék felhalmozódását okozza a

sejtben az rpn13ntd és a K48-diUb közötti komplex szerkezetben az rpn13ntd és a proximális Ub közötti kölcsönhatás hasonló az Rpn13NTD és az Ub monomer közötti kölcsönhatáshoz, amint azt korábban jeleztük (kiegészítő ábra. S10a). Ezért kísérleteket terveztünk az rpn13ntd és a K48-diUb disztális Ub közötti kölcsönhatás funkcionális fontosságának felmérésére. Sok töltött maradék található az rpn13ntd és a K48-diUb disztális Ub közötti határfelületen, ezért az elektrosztatikus erő fontos szerepet játszhat a komplex stabilizálásában (ábra. 4b). Ezek közül a D39 maradék a disztális Ub-ben közel áll az R104 maradékhoz az Rpn13-ban. Így mutáltuk az Rpn13 r104 maradékot glutamáttá, majd az rpn13ntd mutánsát fluoroforral jelölt K48-diubdá titráltuk. A mutáns fehérje gazdagítja a K48-diUb magas FRET fajait (kiegészítő ábra. S11). A kötési affinitás azonban sokkal gyengébbé válik. A kötési izoterma KD értéke 10,0, 3,3, 3m, körülbelül 300-szor gyengébb, mint a wildtype Rpn13NTD (ábra. 4c). Mint ilyen, a disztális Ub-vel való kapcsolat fontos az rpn13 és a K48-diUb közötti specifikus felismerés szempontjából.

az R104E mutáns csökkent kötési affinitása lehetővé tette számunkra, hogy felmérjük az rpn13 és a K48-hoz kapcsolt Ub lánc közötti kölcsönhatás funkcionális jelentőségét. A wildtype rpn13 átmeneti transzfekciója kissé növeli a K48-hoz kapcsolt poliub fehérjék mennyiségét (ábra. 4d). Lehetséges, hogy az Rpn13 transzfekció során felesleges mennyiségű szabad Rpn13 versenyez a K48-hoz kapcsolt poliubfehérjékhez való kötődésért a proteaszómához kapcsolódó Rpn13-Mal, ezáltal az ubiquitinált szubsztrátfehérjék toborzása a proteaszómához kevésbé hatékony. Másrészt az Rpn13 r104e mutáns transzfekciója nagymértékben növeli a K48-hoz kapcsolt poliub fehérjék mennyiségét, összehasonlítva a wildtype Rpn13-mal transzfektált sejtekkel (ábra. 4d). Pozitív kontrollként inkubáltuk a sejteket 1 6-132-vel, egy erős proteaszóma-gátlóval, 36. A labilis fehérjék lebomlásának blokkolása miatt az MG132 hozzáadása jelentősen növeli a K48-hoz kapcsolt poliub fehérjék mennyiségét. Az rpn13 r104e mutációja együttesen ubiquitinált szubsztrát fehérjék felhalmozódásához vezethet. Ez a proteaszómához társuló Rpn13 mutáns és a K48-diUb és a K48-poyUb közötti gyengébb kölcsönhatásnak tulajdonítható.

a hősokk csökkentheti a sejtek életképességét. Megállapítottuk, hogy 30 perc hősokk 43 KB-nál csökkentheti a hek293 sejtek életképességét 75% – ra. Az előző jelentésekhez36,37 hasonlóan azt is megállapítottuk, hogy az MG132 kezelése védő hatással van a sejtek túlélésére hősokk esetén, a sejtek életképessége ~90% – ra csökkent (ábra. 4e). Ez azért van, mert az MG132 gátolja a proteaszomális lebomlást, így az egyébként rövid élettartamú hősokk fehérjék hozzáférhetőbbé válnak (ábra. 4d). Megvizsgáltuk a wildtype Rpn13-Mal transzfektált hőre sokkolt sejtek életképességét is, és nem találtunk szignifikáns különbséget az rpn13 transzfektáció nélküli kontroll sejtekhez képest. Másrészt az Rpn13 r104e transzfektált sejtek sejt életképessége hősokk esetén ~83% – ra csökkent, ami lényegesen magasabb, mint a kontroll sejteké és a wildtype Rpn13-mal transzfektált sejteké (ábra. 4e). Ez azt jelenti, hogy az rpn13 mutáns védő hatással van a sejtek túlélésére hősokk esetén, hasonlóan az MG132 hatásához. Összességében az Rpn13 és a K48-hoz kapcsolt Ub lánc közötti kölcsönhatás elengedhetetlen az ubiquitinált szubsztrát fehérjék rpn13 által közvetített felismeréséhez a proteaszóma által, míg az rpn13 interfaciális pont mutációja bizonyos szubsztrát fehérjék, például hősokk fehérjék felhalmozódását okozhatja, és termotoleranciát kölcsönöz a transzfektált sejteknek.

Rpn13NTD:a K48-diUb interakció megcélozható az rpn13 funkció modulálására

az Rpn13 dinamikusan toborozódik a proteaszómába az Rpn13NTD és az Rpn27,13 C-terminális farka közötti kölcsönhatás révén. A komplex szerkezet itt azt jelzi, hogy a kötési interfész Rpn13NTD Rpn2 közel van, de nem fedi át a kötési interfész a disztális Ub K48-diUb (ábra. 5a). Így előkeverjük az rpn2 (Rpn2CTD) utolsó 16 maradékát Rpn13NTD-vel vagy teljes hosszúságú Rpn13-mal 1:1 arányban, és titráljuk az Rpn13NTD:Rpn2CTD komplexet fluoroforral jelölt K48-diUb-ra. Az rpn2ctd előkeverése növelte az Rpn13NTD:K48-diUb KD értékét 33,1 6,9 nm-ről (ábra. 1g), hogy 66,8 db 13,9 nM (kiegészítő ábra. S12a-c és Fig. 5B), míg csökkent a KD értéke Rpn13: K48-diUb a 119 64 nm-es (ábra. 1d) 43,9-ig (12,8 nM) (kiegészítő ábra. S12d-f és Fig. 5c). Így a mérési bizonytalanságokat figyelembe véve az Rpn2CTD asszociációja csak kis perturbációt okoz az Rpn13 és a K48-diUb közötti kötési affinitásban, aminek szintén köze lehet a linker jelenlétéhez és az Rpn13 C-terminális doménjéhez.

a A K48-diUb disztális Ub kötő felülete az Rpn13NTD – n szomszédos az Rpn2CTD kötő felületével. Val vel Rpn13NTD-Rpn2CTD komplex szerkezet (PDB kód 5V1Y) rpn13ntd, az Rpn2CTD piros rajzfilmként jelenik meg. Az Rpn13 K34 maradék közel van a disztális Ub C-végéhez (szaggatott vonalként ábrázolva). b, c kötési affinitásokat az ekvimoláris rpn13ntd:Rpn2CTD vagy Rpn13:Rpn2CTD fluoroforral jelölt K48-diUb smFRET titrálásából nyertük. A KD értékek jelentik a legjobban illeszkedő adapterek hibáit. d az Rpn2-horgonyzott Ub monomer kötése valószínűleg a disztális Ub azonos kötési felületét foglalja el, ez utóbbi elmozdulását okozva. e, f az smFRET versenykísérletek, további 150 pM Rpn2CTD-Ub fúziós fehérje hozzáadásával 200 nM Rpn13NTD vagy teljes hosszúságú Rpn13 és 150 pM fluoroforral jelölt K48-diUb keverékéhez (c.F. ábra 1c és f). A hiba 1 SD-t jelez az smFRET fajok populációinak három független méréséből

az Rpn2 és a K48-diUb disztális Ub a közeli felületeket foglalja el az Rpn13NTD – n. Ezért az Rpn2CTD C-terminálisához csatolt UB monomerrel rendelkező fúziós fehérje kinyúlhat, és megzavarhatja az Rpn13NTD és a K48-diUb disztális Ub közötti kölcsönhatást (ábra. 5d). Mint bemutattuk, a 200 nM-es Rpn13NTD hozzáadása növeli a 150 pM fluoroforral jelölt K48-diUb magas FRET faj populációját ~63%-ra (ábra. 1f), míg az Ub monomer hozzáadása nem versenyezhet az Rpn13NTD kötésért (ábra. 2c, d). Amikor további 150 pM jelöletlen Rpn2CTD-Ub fúziós fehérjét adtunk hozzá, a magas FRET Fajok populációja ~4%-ról ~59% – ra csökken (ábra. 5e). Másrészt megmutattuk, hogy a 200 nM-es teljes hosszúságú Rpn13 hozzáadása növeli a 150 pM fluoroforral jelölt K48-diUb magas FRET faj populációját ~60%-ra (ábra. 1c). A 150 pM jelöletlen rpn2ctd-Ub fúziós fehérje további hozzáadása ~4,5-~55,5% – kal csökkenti a magas FRET Fajok populációját (ábra. 5f). Vegye figyelembe, hogy az Ub hozzáfűzése az Rpn2CTD-hez szinte nincs hatással az Rpn2CTD és az Rpn13NTD közötti kölcsönhatásra (kiegészítő ábra. S13). Így adataink azt mutatják, hogy az Rpn2 és a K48-diUb kötési interfészek az Rpn13NTD-n közel vannak egymáshoz. Ennél is fontosabb, hogy az Rpn2-horgonyzott Ub fizikailag blokkolhatja a disztális diUb rpn13-hoz való hozzáférését, és gyengítheti a K48-diUb és az Rpn13 közötti kölcsönhatást.