- eredmények
- a KLF2 expressziója csökken a monociták aktiválásával/makrofágokká történő differenciálódásával.
- a KLF2 gátolja a monocita aktivációt és a fagocita kapacitást.
- a KLF2 nem gátolja a monocita toborzást.
- a KLF2 gátolja a karragenán által kiváltott gyulladást.
- a KLF2 Leütésének hatása a gyulladásos génexpresszióra.
- a KLF2 gátolja az NF-kB és AP-1 Promoter tevékenységeket.
- a Koaktivátor CBP-asszociált faktor (PCAF) felvétele a KLF2-vel, mint egyesítő mechanizmus.
eredmények
a KLF2 expressziója csökken a monociták aktiválásával/makrofágokká történő differenciálódásával.
annak érdekében, hogy jobban megértsük a KLF2 szerepét az immunsejtek, például a monocita/makrofág szabályozásában, először értékeltük a KLF2 expresszióját az elsődleges humán monocitákban. Amint az ábrán látható. 1 A bal oldalon a KLF2 expresszió robusztus az elsődleges humán monocitákban, és 5 nap elteltével erősen csökken a makrofágokká történő differenciálódással. KLF2 expresszió a humán monocita sejtvonalban a THP-1 sokkal alacsonyabb volt, mint az elsődleges humán monocitákban. Az expresszió azonban tovább csökkent ezeknek a sejteknek az LPS vagy 12-O-tetradekanoil-forbol-13-acetáttal történő kezelésekor, két olyan szer, amely jól megalapozott a sejtek aktiválásának vagy differenciálódásának kiváltására (ábra. 1 A Jobb).
KLF2 expresszió aktivált monocitákban in vitro és in vivo. (A) A KLF2 mRNS a monocita differenciálódással és aktiválással csökken. A Northern blot analízist humán monocytákból és makrofágokból származó sávonként 10 (balra) összes RNS-sel végeztük. Hasonló analízist végeztünk a THP-1 sejtekből származó, 36 órán át FBS-mentesen tenyésztett teljes RNS-sel, majd további 6 órás stimulációval LPS-sel vagy 12-o-tetradekanoil-forbol-13-acetáttal (jobbra). (B) A KLF2 expresszió az atherosclerosisban szenvedő betegek monocitáiban csökken. A Kvantitatív valós idejű RT-PCR-t 14 betegből (beteg) és 14 egészséges, életkornak megfelelő kontrollból (kontroll) izolált monocitákkal végeztük. A meghatározott gének expressziójának szintjét normalizáltuk a kontroll gén eukarióta transzlációs iniciációs faktorral.
ezután arra törekedtünk, hogy meghatározzuk, hogy a KLF2 expresszió szabályozott-e a gyulladásos környezetben in vivo. A monocitikus aktiváció kulcsfontosságú patofiziológiai esemény az ateroszklerózis kialakulásában, krónikus, alacsony fokú gyulladásos állapotban, ezért úgy érveltünk, hogy a KLF2 expresszió csökkenhet ezeknél a betegeknél (11). Megvizsgáltunk egy 14 életkornak megfelelő normál alanyból és 14 kiterjedt ateroszklerózisban szenvedő betegből álló csoportot (50%, akiknek kórtörténetében koszorúér revaszkularizáció szerepel), akiket a Finkel-Biskis–Jinkins osteosarcoma gén (FOS) legalacsonyabb és legmagasabb szintje rétegez, amelyről kimutatták, hogy a gyulladás markereként szolgál (12). Amint az ábrán látható. 1 B, A KLF2 expresszió szignifikánsan csökkent, 30% – kal a betegeknél. Ezzel szemben nem figyeltek meg szignifikáns hatást a KLF3, KLF6, KLF11 és KLF13 esetében. Korábbi vizsgálatunkkal összhangban az FOS expressziója jelentősen megnőtt koszorúér-betegségben szenvedő betegeknél (12).
a KLF2 gátolja a monocita aktivációt és a fagocita kapacitást.
a gyulladásos ingerekre adott válaszként a monociták megnövekedett proinflammatorikus faktorokat és citokineket/kemokineket expresszálnak, és fokozott fagocitikus kapacitást mutatnak. Ahhoz, hogy betekintést nyerjünk a KLF2 monocita funkcióban betöltött szerepébe, túlexpressziós vizsgálatokat végeztünk. A THP-1 sejteket vagy kontroll üres vírussal (EV) vagy KLF2-vel (Ad-KLF2) fertőztük meg 24-48 órán keresztül, majd LPS-vel stimuláltuk 2 és 6 órán keresztül. 2 A, az EV-fertőzött sejtek kezelése LPS-vel (25 ng/ml) a ciklooxigenáz (COX)-2, szöveti faktor és monocita kemoattraktáns fehérje (MCP)-1 mRNS robusztus indukcióját eredményezte. Ezzel szemben ez az indukció jelentősen gyengült a KLF2-fertőzött sejtekben (ábra. 2 A). Hasonló hatásokat figyeltek meg az egér j774a monocita sejtvonalában is (az adatok nem jelennek meg). Továbbá a KLF2 túlzott expressziója erősen gátolta a különböző citokinek és kemokinek szekrécióját. Amint az ábrán látható. 2b, a KLF2 túlzott expressziója gyengítette az olyan tényezők LPS által közvetített indukcióját, mint a CD40L (49,6%-kal), a makrofág gyulladásos fehérje 1 (48,4%), a makrofág gyulladásos fehérje 1 (64,2%), az IL-1 (55,0%), az IL-8 (79,1%), a TNF-KB (50,2%) és az MCP-1 (68,8%). Ez a hatás specifikus volt, mivel nem figyeltek meg szignifikáns hatást több más releváns növekedési faktor (TGF 61, thrombocyta-eredetű növekedési faktor és granulocyta/makrofág kolónia-stimuláló faktor), citokinek/kemokinek (IL-4, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-1 és IFN-6) vagy mátrixmódosító enzimek (1-es, 2-es, 3-as és 9-es típusú mátrix metalloproteináz) szintjeire (az adatok nem szerepelnek).
a KLF2 túlzott expressziója gátolja a monocita aktiválódást. (A) A KLF2 túlzott expressziója gátolja a gyulladásos génexpressziót. Az északi blot analízist a jelzett tényezőkre végeztük 10-vel a teljes RNS / sáv a THP-1-ből ad-KLF2-vel (KLF2) vagy EV-vel túlexpresszálva kontrollként LPS-sel történő stimuláció után különböző időpontokban, a jelzett időpontokban. (B) A KLF2 túlzott expressziója gátolja a citokin/kemokin kidolgozását. Milliliterenként egymillió THP-1 sejtet fertőztünk meg EV vagy KLF2 adenovírussal 24 órán keresztül, majd LPS stimulációt folytattunk további 2 órán át vagy 6 órán keresztül. Minden mintát két példányban értékeltünk, és két független kísérletet értékeltünk egy biológiai markerekből álló panelre. Hasonló eredményt figyeltek meg különböző kísérletekkel. (C) A KLF2 gátolja a fagocitózist. EV – és KLF2-fertőzött THP-1 sejteket stimuláltunk LPS-sel (25 ng/ml), és fagocitózis vizsgálatot végeztünk az anyagokban és módszerekben leírtak szerint. (D és e) a KLF2 nem gátolja a monocita toborzást. A D-ben az I.p. után a peritoneális üregbe toborzott GFP-pozitív sejtek reprezentatív áramlási citometriás elemzését mutatjuk be tioglikolát injekció. A kapuzott sáv jelzi a GFP-pozitív sejtek százalékos arányát az elemzésben. Az e-ben csoportonként n = 5 egér összefoglaló eredményeit adjuk meg. (F) immunhiányos egerek anyagokban és módszerekben leírt REKONSTITÚCIÓJA KLF2-túlexpresszált J774a sejtekkel csökkent ödémát tár fel mind az 1-h, mind a 2-h karragén okozta gyulladás periódusaiban. Az adatokat sem (n = 4) – ben fejezzük ki. (G) a KLF2 csökkenti a szöveti ödémát. A karragénnel beinjektált mancsok keresztmetszeteit (600 nagyítás) hematoxilinnel és eozinnal festettük. A KLF2-túlexpresszált monocitákkal rekonstruált egerek mancsai csökkent extravazált folyadékot mutatnak nyilakkal jelölve. Az olyan tereptárgyak, mint az izmok (M) és a csontok (B) jelennek meg. (H és I) A KLF2 leütése növeli a proinflammatorikus génexpressziót. A J774a sejteket nem specifikus (ns) vagy siRNS-sel transzfektáltuk KLF2-re (siKLF2) a 48-h célgénekhez, amelyeket Northern blot analízissel (H) és Kvantitatív valós idejű PCR analízissel (I) értékeltünk. Az I grafikonjai három kísérlet kombinált adatait képviselik.
az aktivált monocita/makrofág klasszikus jellemzője a fagocitózis. Annak meghatározására, hogy a KLF2 túlzott expressziója befolyásolja-e a monociták fagocitikus képességét, túlexpresszáltuk a KLF2-t vagy a kontrollt (ev) a THP-1 sejtekben, LPS-szel stimulálva, és megvizsgáltuk ezeknek a sejteknek a képességét, hogy felvegyék a Texas vörös jelölésű zymosan a biorészecskéket. Amint az ábrán látható. 2 C, kontroll vírussal fertőzött sejtek lenyelték a zymosan biorészecskéket. Ezzel szemben a klf2-expresszáló monociták felvétele jelentősen csökkent (ábra. 2 C). Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a KLF2 gátolhatja a citokinek/kemokinek monocita szekrécióját és a fagocitózist.
a KLF2 nem gátolja a monocita toborzást.
ezután arra törekedtünk, hogy felmérjük a KLF2 hatását a monocita funkcióra in vivo. Sérülésre vagy gyulladásos ingerre reagálva a monocitákat a véráramból a szövetekbe toborozzák. Először tanulmányokat végeztünk annak felmérésére, hogy a monocita toborzást megváltoztatta-e a KLF2 expresszió. Más sejttípusok hozzájárulásának minimalizálása érdekében C. B-17-Scid-bézs egereket használtunk, amelyekben hiányzik a T, B és a természetes gyilkos sejtek. Ezeket az állatokat (csoportonként n = 5) ezután teljes test besugárzásnak vetettük alá, és farokvénás injekcióval (anyagokban és módszerekben leírtak szerint) j774a sejtekkel vagy kontrollvírussal (EV) vagy KLF2-vel adenovirálisan fertőzött J774a sejtekkel állítottuk elő. Az állatokat ezután tioglikolát (egy erős kémiai irritáló anyag, amely monocyta-toborzást indukál) i.p. injekciójának vetették alá, majd a GFP-pozitív sejtek számát 48 órával később áramlási citometriás analízissel értékelték. Amint az ábrán látható. 2 C és D, A KLF2 nem gátolta a GFP+ J774a monociták toborzását a peritoneális üregbe. Valóban, reprodukálhatóan megfigyeltük, hogy a KLF2-transzdukált állatok jelentős növekedést mutattak a GFP + sejtekben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a KLF2 nem gátolja, hanem fokozza a monocitikus toborzást egy gyulladásos helyre.
a KLF2 gátolja a karragenán által kiváltott gyulladást.
a szövetekbe történő toborzás és migráció után a monociták citokineket, kemokineket és növekedési faktorokat választanak ki a gyulladásos válasz állandósítására. Amint az ábrán látható. 2b, megjegyeztük, hogy a KLF2 túlzott expressziója gyengítette számos citokin és kemokin kialakulását. Annak megállapítására, hogy a KLF2 befolyásolja-e a monocitikus proinflammatorikus funkciót, jól bevált modellt használtunk a gyulladáshoz: karragenán által kiváltott lábpad injekció. Ennek a vegyi anyagnak az injektálása korábban kimutatták, hogy reprodukálhatóan gyulladásos reakciót vált ki, amelyet mancsödéma jellemez (13-15). A C. B-17-Scid-bézs egereket (csoportonként n = 4) a fent leírtak szerint besugároztuk, kontroll vagy KLF2-expresszáló J774a sejtekkel rekonstruáltuk, majd karragenán injekcióval kihívtuk a lábpadba (Leírás: Anyagok és módszerek). A mancs térfogatát kis térfogatokra módosított hidropletizmométer segítségével határoztuk meg (Ugo Basile, Milánó). Amint az ábrán látható. 2 F, EV-fertőzött állatok 17 6,08 mm3 és 23,3 3,05 mm3 növekedést mutattak a mancs térfogatában 1, illetve 2 óra karragén injekció után. Ezzel szemben a KLF2-expresszáló J774a sejtekkel rekonstruált állatok csak 6,25 0,85 mm3 és 7,5 0,95 mm3 növekedést mutattak a mancs térfogatában 1 és 2 órával a karragén injekció után (ábra. 2 F). Ezzel a bruttó hatással összhangban a mancsok szövettani elemzése csökkentette a folyadék extravazációját, ami ödéma kialakulásához vezet (ábra. 2 G, nyilak).
a KLF2 Leütésének hatása a gyulladásos génexpresszióra.
a KLF2 fontosságának meghatározása a monocitikus gyulladásos génexpresszióban, kis interferáló RNS (siRNS) által közvetített leütési vizsgálatokat is végeztek. Amint az ábrán látható. 2 H, összehasonlítva a kezeletlen (kontroll) és nem specifikus siRNS-sel kezelt sejtekkel, a KLF2 leütése (60% leütés) a J774a sejtekben olyan gyulladásos gének indukcióját eredményezte, mint az MCP-1, és szerényebb hatást gyakorolt a COX-2-re és a szöveti faktor expressziós szintekre. Ezeket az eredményeket valós idejű PCR analízissel is ellenőriztük (ábra. 2 I).
a KLF2 gátolja az NF-kB és AP-1 Promoter tevékenységeket.
a KLF2 hatékonyan gátolja az MCP-1, a COX-2 és a szöveti faktor LPS által közvetített indukcióját (ábra. 2 A). Ezeknek a céloknak a proinflammatorikus ingerekkel történő indukcióját transzkripciós utak, például NF-kB és AP-1 szabályozzák. Ezt indokoltuk, elvben, a KLF2 gátolhatja ezeket az útvonalakat több szinten, például expresszió, DNS-kötés, vagy transzkripciós aktivitás indukálása.
először az NF-kB-ra összpontosítottunk, tekintettel annak központi szerepére a gyulladásban. A KLF2 túlzott expressziója nem változtatta meg a P65 nukleáris felhalmozódását vagy az IkB kináz (IKK) és ikky nukleáris szintjét (ábra. 3 A). Továbbá a KLF2 túlexpresszió nem változtatta meg az Ikka, IKK és Ikky IkB foszforilációjának, degradációjának vagy citoplazmatikus szintjének kinetikáját. 3 B). Ezekkel a megfigyelésekkel összhangban a KLF2 nem befolyásolta az NF-kB kötődését a DNS-hez. Amint az ábrán látható. 3 C, a kontroll vírussal fertőzött sejtek (EV) kezelése LPS-sel egyetlen fő sávot indukált. A verseny-és szupereltolódási vizsgálatok igazolták, hogy ez a sáv NF-6db-t jelent. Az NF-kB kötés közel azonos mintázatát figyelték meg a KLF2-t túlexpresszáló sejtekben. Annak felmérése, hogy a KLF2 befolyásolhatja-e az NF-kB által közvetített transzkripciós aktivációt, génriporter vizsgálatokat végeztek. Amint az ábrán látható. 3 D, A P65 transzfekciója NF-kB luciferáz reporter plazmiddal transzkripciós aktivitást indukált kb 11-szeresével. Ez az indukció klf2 jelenlétében erősen csökkent, ami azt jelzi, hogy a KLF2 gátolja az NF-kB transzkripciós aktivitást. A KLF2 hasonló hatásait figyelték meg az AP-1 útvonalon (ábra. 5 A-C, amelyet támogató információként tesznek közzé a PNAS webhelyén).
a KLF2 gátolja az NF-kB transzkripciós aktivitást. (A és B) A KLF2 nem változtatja meg az NF-kB útvonal komponenseinek expresszióját. A THP-1 sejteket adenovírussal (EV vagy KLF2) fertőztük meg, LPS-sel stimuláltuk 30 percig, 1 órán át vagy 2 órán keresztül, és Western blot analízissel értékeltük a jelzett faktorok expresszióját nukleáris és citoplazmatikus kivonatok felhasználásával. C) A KLF2 nem befolyásolja az NF-kB DNS-kötődést. A THP-1 sejteket adenovírussal (EV vagy KLF2) fertőztük meg, és LPS-vel stimuláltuk 1 órán keresztül, és magkivonatokat használtunk a géleltolódási vizsgálatokhoz. Az NF-kB sávot nyíl jelöli. A specificitást verseny-és szupereltolódási vizsgálatok igazolták. (D) A KLF2 gátolja az NF-kB concatemer p65 által közvetített tranzakcióját. Átmeneti transzfekciós vizsgálatokat végeztek RAW264.7 sejtekben a jelzett konstrukciókkal. Ezeket a kísérleteket három példányban hajtották végre, és legalább háromszor megismételték.
a Koaktivátor CBP-asszociált faktor (PCAF) felvétele a KLF2-vel, mint egyesítő mechanizmus.
együttesen, az eredmények ábra. 3 jelölje meg, hogy a KLF2 gátolhatja az NF-kB által közvetített transzaktivációt, függetlenül az ezen faktorok DNS-kötődésére gyakorolt hatásoktól. Az egyik lehetséges mechanizmus a kritikus koaktivátorok toborzása. Például az optimális NF-kB kötés több kulcsfontosságú koaktivátorral való kölcsönhatást igényel, mint például a szteroid receptor koaktivátor (SRC)-1, PCAF és p300/CBP. A KLF2 kölcsönhatásba léphet egy vagy több ilyen tényezővel, toborozhatja őket az NF-kB-tól, következésképpen csökkentheti az NF-kB által közvetített transzkripciós aktivitást.
a PCAF szerepének meghatározása az NF-kB transzkripciós aktivitás KLF2 által közvetített gátlásában kotranszfekciós vizsgálatokat végeztünk exogén PCAF-mal. PCAF transzfekciója (de nem p300; az adatok nem jelennek meg) jelentősen megmentette az NF-kB concatemer KLF2 által közvetített elnyomását (ábra. 4 A). Részleges mentést figyeltek meg a KLF2 azon képességéről is, hogy gátolja az AP-1 transzkripciós aktivitást (ábra. 5D). Annak megállapítására, hogy a KLF2 és a PCAF kölcsönhatásba lépnek-e egymással, GST lehúzási és coimmunoprecipitációs vizsgálatokat végeztünk. In vitro átírt és lefordított termékek felhasználásával azt találtuk, hogy a KLF2 és a PCAF közvetlenül kölcsönhatásba léphet egy sejtmentes rendszerben (ábra. 4 B). Ahhoz, hogy tudjuk, hogy a PCAF in vivo kötődik-e a KLF2-hez, túlexpresszáltuk a KLF2-t (hemagglutinin-tagged) és a PCAF-ot (Flag-tagged) a COS-7 sejtekben. Immunprecipitáció Anti-Flag antitesttel, majd Western blot egy anti-hemagglutinin antitesttel azt mutatta, hogy a KLF2 kötődik a PCAF-hez a sejtekben (ábra. 4 C).
a KLF2 közvetlenül kapcsolódik a PCAF-hez. (A) A PCAF túlzott expressziója megmenti az NF-kB transzkripciós aktivitás KLF2 által közvetített gátlását. A jelzett plazmidokkal átmeneti transzfekciós vizsgálatokat végeztünk RAW264.7 sejtekben a korábban leírtak szerint (n = 9-12 csoportonként). (B) A KLF2 kölcsönhatásba lép a PCAF-vel egy sejtmentes rendszerben. A kötési kísérleteket PCAF és GST-KLF2 in vitro transzkriptált és transzlált termékeinek (TNT) felhasználásával végezték. Az autoradiográf adatok (felső) és a coomassie festés a gél (alsó)jelzik a terhelés mennyiségét és a PCAF fehérjét ( ^ ). A bemenet a PCAF-TNT 2% – a. C) A KLF2 és a PCAF kölcsönhatásba lép a sejtekben. A COS-7 sejteket a jelzett konstrukciókkal transzfektáltuk, és immunprecipitációs vizsgálatokat végeztünk az anyagokban és módszerekben leírtak szerint. D) A KLF2 csökkenti a PCAF toborzását. A THP-1 sejteket Ad-KLF2-t vagy EV-t tartalmazó vírussal fertőztük meg, és LPS-sel stimuláltuk, és ChIP-vizsgálatokat végeztünk a COX-2 promoter jelzett tényezőire vonatkozóan (a részleteket lásd anyagok és módszerek).
annak meghatározására, hogy a megfigyelt hatások alapjául szolgáló mechanizmusok működnek-e in vivo, vállaltuk kromatin immunprecipitációs (ChIP) vizsgálatok. Ahogy az várható volt, a THP-1 sejtek LPS stimulálása a p65 és a PCAF COX-2 promoterbe történő felvételéhez vezetett (ábra. 4 D). Emellett megfigyelték a HH3 és HH4 egyidejű acetilezését. A KLF2 túlexpresszió összefüggésében azonban a PCAF toborzás és a hiszton acetilezés egyaránt erősen attenuált (ábra. 4 D). A géleltolódási vizsgálatainkkal összhangban a KLF2 nem volt szignifikáns hatása a p65 toborzásra.
