Vita
a megfigyelt magas szintű proteázaktivitás termelése a k folyamatos tenyésztése során. a sedentarius elősegítette két proteáz, a P1 és a P2 tisztítását, amelyek aktívak voltak az azokazein, az inzulin, az emberi kalluszból kivont keratin és a feldolgozatlan kallusz ellen. Ezen enzimek általános jellemzői, beleértve a szubsztráttartományt, az optimális hőmérsékletet és a pH-t, valamint a proteázgátlókkal szembeni érzékenységet, arra utalnak, hogy biokémiailag hasonlóak, és valószínűleg az alkáli szerin proteáz családba tartoznak. Ezeket a proteázokat sokféle mikroorganizmus termeli, és endopeptidázként működnek (Rao et al. 1998).
az, hogy az enzimek keratinázként is besorolhatók-e, továbbra is vita tárgyát képezi. A keratinázoknak definíció szerint képesnek kell lenniük a tiszta natív keratin hidrolizálására. A keratin extrakciója azonban csak denaturáló szerekkel történő előzetes kezeléssel érhető el, hogy elkülönítse a nem keratin fehérjéktől. A mechanikus kezelések, mint például a golyósmarás, diszulfidkötések hasadását eredményezik, amelyek a fehérjét érzékenyebbé teszik a proteolitikus emésztésre olyan proteázok által, mint a tripszin és a proteináz K, amelyek nem tartoznak a keratinázok közé (Noval and Nickerson 1959). Hasonlóképpen kritizálták a hősterilizált szubsztrátok használatát a keratináz vizsgálatokban is, mivel a melegítés keratin denaturációt okozhat.
bár a jelen vizsgálatban finoman őrölt kalluszt használtunk enzim szubsztrátként, a tenyészet felülúszó folyadék aktív volt az ép kallusz darabjaival szemben. Ezért, még akkor is, ha a két proteáz nem szigorúan keratináz, in vitro lebontják az emberi kalluszt, és van némi bizonyíték arra, hogy ez in vivo is előfordul (Nordstrom et al. 1987).
a proteázokat redukált keratinra gyakorolt aktivitásuk eredményeként keratinázként is besorolták, ebben az esetben redukálószereket adtak az enzimvizsgálati keverékhez, vagy keratin extrakció során alkalmazták. Bár számos bőrbaktérium keratinolitikus aktivitását tanulmányozták natív keratin szubsztrátként, a redukálószert, a ditiotreitolt (DTT) is bevonták a vizsgálati keverékbe. Például, amikor a Staphylococcus epidermidis látszólagos keratináz aktivitását DTT hiányában tanulmányozták, nem észleltek aktivitást (Mikx és De Jong 1987). Hasonlóképpen, a szerin proteáz Candida albicans-lebontott keratinok, hogy már kivont a stratum corneum az emberi talp 8 mol l – 1 karbamid a Tris-HCl és a kb-merkaptoetanol (Hattori et al. 1984). Ebben a vizsgálatban a P1 és P2 hidrolizált keratint, amelyet karbamiddal és Ca-merkaptoetanollal vontak ki az emberi láb kalluszából, de ami fontos, képes volt lebontani a kezeletlen kalluszt is.
a stratum corneum és az emberi kallusz összetett és stabil szerkezet, amelynek a keratin fő összetevője. 30 emberi gén van a keratin számára, amelyek közül 18 a bőrön expresszálódik (Fuchs 1995). A keratin adatbázis összefoglalása kimutatta, hogy minden keratin potenciális hasítási helyekkel rendelkezik a proteázok számára, és az Asp‐Arg és a Gly‐Arg a leggyakoribb. Ha a keratinszálak kezdetben ezeken a helyeken megszakadnak, akkor lehetséges, hogy ezeknek a kisebb egységeknek a fokozatos lebomlása másodlagos hasítási helyeken történik, peptidfragmensek mérettartományát eredményezve, amint azt az emberi kalluszból kivont keratinok elleni proteáz támadás elemzése mutatja. Az eredmények ábrán bemutatott. 3b jelöljön két pH-optimát a P2 kalluszbontó aktivitására. Az egyik lehetséges magyarázat az, hogy két enzim van a mintában. Ez valószínűtlennek tűnik, mert az alkalmazott enzimminta nagy tisztaságú volt, amint azt az EZÜSTFESTÉSSEL ellátott oldal mutatja (Lásd az ábrát. 1, sáv 6). Nem zárható ki annak a lehetősége, hogy a tisztított P2 mintában két kalluszbontó enzim található, amelyek nagyon hasonló mobilitással rendelkeznek az oldalon. Ugyanakkor ugyanazt a mintát ugyanazokkal a pufferekkel vizsgáltuk azokazein assay-vel, és csak egy Ph-optimumot detektáltunk 10·2 pH-n. Alternatív magyarázat az, hogy a komplex kallusz szubsztrát/enzim kölcsönhatás különböző pH-knál az enzimaktivitás és a szubsztrát finom konformációs változásainak egyensúlya, ami kettős pH-optimához vezet.
ez a vizsgálat kimutatta, hogy a K. sedentarius két extracelluláris proteázt termel, amelyek kalluszbontó aktivitással rendelkeznek. Meghatározták a relatív molekuláris méretükre, a pi-kre vonatkozó alapvető információkat. A hagyományos enzim kinetikai vizsgálatokkal azonban nem lehetett foglalkozni, mivel az ezekben az in vitro kísérletekben használt természetes szubsztrát polimerek komplex keveréke volt, vízben oldhatatlan. A P2 fokozott enzimaktivitása 800 mmol 1-1 só jelenlétében releváns lehet a mikroorganizmus túlélése szempontjából az emberi bőrön, amelynek sókoncentrációja változó az eccrin mirigy aktivitásától függően, amelyet az ember testmozgási sebessége és környezeti hőmérséklete határoz meg. A nátrium-klorid hatás mechanizmusával(mechanizmusaival) nem foglalkoztak. Kísérletileg javasolt, hogy a nátrium-klorid befolyásolhatja az enzim és a szubsztrát tercier szerkezetét, vagy mindkettőt, hogy javítsa az enzimek aktív helyének hozzáférését a szubsztrát specifikus hasítási helyeihez.
a megfigyelt eredmények legegyszerűbb magyarázata az, hogy a K. sedentarius felülúszó tenyészetében két kalluszbontó enzim, szerin proteáz található, amelyek szintén oldják a kalluszban jelen lévő humán keratint. Lehetséges, hogy K. a sedentarius egy proteázt termel, amelyet egy gén kódol, és az autokatalitikus vagy más proteázaktivitás két különböző molekulatömegű enzimet termel. Alternatív megoldásként két gén kódol két független és szorosan kapcsolódó enzimet. Ez utóbbi hipotézist egy korábbi tanulmány támasztja alá (Holland et al. 1992). A K. sedentarius folyamatos tenyésztéséből származó minták egyensúlyi állapotban, különböző hígítási sebességgel, a page-en vizsgálva és kazeinnel borítva két enzimet mutattak, az egyiket konstitutív, a másikat pedig nagy koncentrációban, alacsony hígítási sebesség mellett detektálták. Fontos, hogy a hígítási arányok közelében 6max nem volt kimutatható. A P1 (21 maradék) és a P2 (15 maradék) polipeptidek N‐terminális aminosav-szekvenciájának meghatározása azt mutatta, hogy teljesen különböznek egymástól. Ez az eredmény a folyamatos tenyésztési kísérletből származó információkkal együtt azt sugallja, hogy az enzimek egymástól függetlenül vannak kódolva.
e vizsgálat eredményei megerősítették azt a hipotézist, miszerint a K. sedentarius specifikus proteázai magyarázhatják a kallusz lebomlását, amely a kimagozott keratolízisre jellemző. Az eddigi bizonyítékok arra is utalnak, hogy két proteáz vesz részt, amelyek aktívak a bőr pH-ján, pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). Az in vitro kísérletekből származó eredmények értelmezése az in vivo környezetben megkérdőjelezhető, annak ellenére, hogy szubsztrátként emberi kalluszt használtunk. Ideális esetben az emberi bőr biopsziát kell venni, beleértve a normál és a kimagozott bőrterületeket is. A proteázok jelenlétét, elhelyezkedését vagy hiányát szövettani módszerekkel lehet meghatározni, monoklonális antitesteket használva a proteázok és a K. sedentarius vizsgálataként. Etikai jóváhagyást azonban nem adnának biopsziák a szükséges helyről, a láb teherhordó helyéről, reprezentatív számú embertől. A K. sedentarius részvétele a kimagozott keratytosisban a keratint lebontó proteázok termelési mechanizmusával hivatalosan nem bizonyított. A hipotéziseket azonban nem cáfolják, hitelességét az itt bemutatott eredmények megerősítették. Erős in vitro bizonyítékot mutattak be arra, hogy a K. sedentarius és extracelluláris kalluszt lebontó enzimei keratolízist váltottak ki. Normál bőr pH-érték és felületi hidratáció esetén ezeknek az enzimeknek a termelése és aktivitása alacsony lesz, a P1 pedig aktívabb. Az elzáródás és a gyenge hygeine környezeti körülményei között a bőr pH-ja a semlegesség felé mozog, és kissé meghaladja. Ezek a feltételek kedveznek a P2-nek. Mindkét enzim valószínűleg tisztító enzim, lehetővé téve a K. sedentarius számára, hogy szén-és nitrogénforrásokat, kis peptideket nyerjen a rezidens és oldhatatlan komplex polimerben, a keratinban. Jelenleg ezen enzimek termelésének szabályozása nem ismert, csakúgy, mint relatív hozzájárulásuk a kallusz lebomlásához in vivo. A klinikai következmények mellett a keratinolitikus proteázok jelentős értéket képviselnek a kereskedelmi szektor számára, mivel számos ipari folyamatban hasznosak, beleértve a baromfi – és bőripar keratinhulladékának lebomlását (Shih 1993; Onifade et al. 1998). A K magas keratinolitikus aktivitása. a sedentarius proteázok viszonylag alacsony hőmérsékleten és pH-értéken, sok más proteázhoz képest, ezeknek az enzimeknek a potenciális alkalmazását mutatják be a biotechnológiai iparban.
