zebrafish karbantartás és készletek: a zebrafish-t (Danio rerio) a megállapított protokollok szerint nevelték fel és állították színpadra 30.Transzgenikus vonalak a következők voltak:TG(kdr-l:ras-mCherry)s91631, Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, Tg(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-MCHERRY)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, TG(fli1: GAL4FF)ubs37, Tg(uas:EGFP-UCD)ubs1835, TgBAC(pdgfrb:GFP)ncv2236 és Tg (kdrl:EGFP)s84337. Az összes állatkísérletet a RIKEN Kobe Branch (Iacuc) intézményi állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.
plazmidok és oligonukleotidok: a Zebrafish marcksl1a-t, marcksl1b-t és fscn1a-t PCR-rel klónozták 1 dpf-embrió cDNS-éből NEB ons PCR klónozó készlet alkalmazásával. Az ebben a vizsgálatban használt összes expressziós konstrukciót a átjárón keresztül generáltuk a DG-klónozás és / vagy fúziós DG-klónozás során a DG-klónozás során a Tol2Kit38 plazmidjainak felhasználásával. A mutált Marcksl1a-t és Marcksl1b-t tartalmazó plazmidokat a Q5 (Neb) Helyirányított mutagenezis-készlet (Site-Directed mutagenesis kit) alkalmazásával állítottuk elő. az shRNS-t tartalmazó vektorokat shRNS-szekvencia lekötésével állítottuk elő az EcoRI és a pmei helyek között a módosított pEGFP-U6 vektor39 U6 promoterétől lefelé (ajándék Zuoshang Xu – tól, Addgene plasmid #19799). Az emberi MARCKSL1 célszekvenciája 5′-GTGTGAACGGAACAGATGATG-3′. A kódolt shRNA 5′-gagtcatgggtcagttatatg-3 ‘ szekvenciát a MARCKSL1 shRNA nem egyező szekvenciájaként (aláhúzva) tervezték. A marcksl1, Marcksl1-S120A/T148A/T183A (Marcksl1-AAA) és marcksl1-S120D/T148D/t183d (marcksl1-DDD) egeret tartalmazó vektorok pEGFP-N1 (Clontech)10-be alklónozva Eleanor T. Coffey (Turkui Egyetem) ajándékai voltak. Az ebben a vizsgálatban használt plazmidokra és primerekre vonatkozó részletes információk az 1., illetve a 2. Kiegészítő táblázatban találhatók.
RNS izolálás és cDNS szintézis: A teljes RNS-t Tri reagenssel (epigenetika) és a Direct-zolTM RNS MicroPrep kit (Zymo Research) segítségével izoláltuk, a cDNS-t pedig a gyártó protokolljai szerint a III.
konstrukciók és transzgenikus zebrahalvonalak Mozaikkifejezése: Tol2-alapú expressziós konstrukciókat (5-10 pg) együtt injektáltunk egysejtű stádiumú zebrafish embriókba 50 pg Tol2 transzpozáz mRNS-vel, amelyet NotI-linearizált pCS-TP vektorból írtak át (Koichi Kawakami ajándéka, Nemzeti Genetikai Intézet, Japán) az mMESSAGE mMACHINE SP6 készlet (Invitrogen) segítségével. A transzgének mozaikos expressziójához az embriókat injekció után 1 vagy 2 dpf-en elemeztük. A Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25 és a Tg(fli1ep:EGFP-PLC1)Rk26 vonalak létrehozásához injektált embriókat neveltek fel felnőtteknek, és megvizsgálták az alapítókat.
zebrafish Marcksl1a és marcksl1b mutánsok generálása: a marcksl1a mutánsokat CRISPR/Cas9 által közvetített mutagenezis hozta létre. Egyvezető RNS (sgrns), amely a második exont célozza meg (Kiegészítő ábra. 4A) klónozástól független protokoll40 használatával jött létre. A Cas9 / sgrns RNP komplexet közvetlenül az injekció beadása előtt állítottuk össze, majd 5 perc szobahőmérsékleten történő inkubálás után 200 pg Cas9 fehérjét (Invitrogen) és 100 pg sgrns-t injektáltunk együtt egysejtű TG(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 embrióba. a marcksl1b mutánsokat TALEN által közvetített mutagenezis generálta. TALEN célzó első exon marcksl1b (kiegészítő ábra. 4B) felhasználásával tervezték Tal effektor nukleotid Targeter 2.0 (https:// tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old), és a Golden Gate módszeren keresztül állították össze41. A TALEN repeat variable di-maradékokat (RVD-ket) klónoztuk egy RCIscript-GoldyTALEN vektorba (Addgene), és minden Talen esetében a felső határos mRNS-eket in vitro átírtuk Saci-linearizált expressziós plazmidokból mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen) segítségével. Egysejtű TG (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 embriókat mikroinjekcióztunk 200 pg RNS-sel (mindegyik bal és jobb TALEN mRNS-ből 100 pg). Az F0 alapítókat a talen vagy a CRISPR/Cas9 által injektált halak wildtype halakkal történő keresztezésével, valamint az utódok mutációinak szűrésével 2 dpf-en T7 endonukleáz I (NEB) assay (TALEN-injektált halak esetében) vagy Sanger szekvenálással (CRISPR/Cas9-injektált halak esetében). Röviden, a genomi DNS-t öt embrióból álló csoportokból izoláltuk HotSHOT módszerrel 42 és a megfelelő genomi régiókat amplifikáltuk. A mutációkat tisztított PCR termékek közvetlen szekvenálásával értékeltük. A pozitív F0 F1 utódait felnőtté nevelték, és a mutációk heterozigóta hordozóit fin-clipping és rutin genotipizáló PCR analízissel azonos primerek alkalmazásával azonosították.
a szűrés során hat mutáns allélt azonosítottak a marcksl1a-ban és öt mutáns allélt a marcksl1b-ben (kiegészítő ábra. 13). Az rk23 allél 2-nt deléciót tartalmaz, amely az 51 aminosav után kereteltolódáshoz, az 56 aminosavnál pedig az 5 missense aminosav után korai stop kodonhoz vezet (kiegészítő ábra. 4a, c). Az rk24 allél 5-nt deléciót tartalmaz, amely a 13.aminosav után kereteltolódáshoz, a 17. aminosavnál pedig korai stop kodonhoz vezet 4 missense aminosav után (kiegészítő ábra. 4b, d). Ezen okok miatt a marcksl1ark23-at és a marcksl1brk24-et nulla allélnak tekintjük, és vizsgálatainkat ezeknek a mutánsoknak az elemzésére összpontosítottuk.
élő képalkotás: az embriókat 0,8% alacsony olvadáspontú agarózba (Bio-Rad) szereltük 0,16 mg/mL Trikain és 0,003% feniltiourea tartalmú E3 táptalajba. A konfokális z-halmokat egy fordított Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1 forgó korong konfokális mikroszkóppal szereztük be, amely Zyla 4.2 CMOS kamerával (Andor) volt felszerelve. A fényes mező képeket a Leica M205FA mikroszkópon szerezték be. A képeket Fidzsi-szigetek (NIH) segítségével dolgoztuk fel.
lézeres abláció: a lézeres ablációkat 405 nm-es lézer (Andor) és FRAPPA modul (Andor) segítségével végeztük, amely egy invertált Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1 konfokális mikroszkópra volt felszerelve Olympus UPLSAPO 60x/NA 1.2 vízimmerziós objektívvel. Három egymást követő lézeres ablációt alkalmaztunk, amelyek tartózkodási ideje 1000 Ft volt, egyenként 51% – os lézerteljesítmény mellett.
Mikroangiográfia: a Mikroangiográfiát vad típusú marcksl1ark23, marcksl1brk24 és marcksl1ark23 embriókon végezték;marcksl1brk24 embriók. Összesen 2 és 3 dpf embriót injektáltak 1-2 nL dextrán-tetrametil-rodaminnal vagy dextrán-fluoreszceinnel (MW = 2000 kDa, Invitrogén) 10 mg/mL-en, és azonnal leképezték. A konfokális z-kötegeket egy Olympus UPLSAPO 10 db / NA 0,4 objektívvel szereztük be. A teljes embrió lefedéséhez több régiót ábrázoltak és varrtak a Fiji43 varrási plugin segítségével.
Sejtátültetés: 15-25 donorsejtből álló csoportok a marcksl1ark23-ból;a marcksl1brk24 mutáns embriókat Tg-ben(kdr–l:ras-mCherry)s916 háttérrel a blastoderma véletlenszerű helyzetéből gyűjtöttük össze, és a wildtype recipiens embriók blastoderm44 laterális marginális zónájába ültettük át 4,5-6 hpf-en. Az extrakciót és a transzplantációt CellTram 4R olaj mikroinjektorral (Eppendorf), boroszilikát üvegkapilláris gc100-15 (Harvard Apparatus Ltd), p-87 vízszintes mikropipetta húzóval (Sutter Instrument Co.) és egy MF-900 microforge (Narishige), hogy egy ‘kanál’ alakú sima hegyet kapjon. A transzplantáció során az embriókat 0,5 x E2 pufferrel ellátott agarózzal bevont petri-csészékben tartják . 2 dpf-nél mcherry-pozitív ISV-kkel rendelkező embriókat választottak ki mikroangiográfiához és képalkotáshoz. Összesen nyolc független transzplantációt végeztek.
kémiai kezelések: a Latrunculin B-t (Merck Millipore) DMSO-ban 1 mg/ml-re oldottuk, és -20 666-on (SIGMA) tároltuk DMSO-ban 50 mM-re, és 4 6c-n tároltuk.minden vegyületet a kívánt koncentrációra hígítottunk E3 pufferben.
Transzfekciós, siRNS által közvetített fehérje leütés és nyírófeszültség kísérlet: a HUVECs-eket (Lonza, C-2519A) EGM táptalajon (Lonza) tenyésztettük, és a 4.átjárásig használtuk. A plazmid transzfekciók esetében a sejteket Opti-MEM táptalajba (Gibco) vetettük be 5,8 kb/104 sejt / cm2-en poli-l-lizin és zselatin bevonatú fedőlapokon, majd 2 KB / g plazmiddal transzfektáltuk Lipofectamine 3000 (Thermofisher Scientific) alkalmazásával. Két órával a transzfekció után az Opti-MEM táptalajt antibiotikumok nélküli EGM táptalajra változtattuk. SiRNS transzfekcióhoz, HUVECs (7.9-104 sejt/cm2) transzfektáltunk 20 nM-es siRNS-sel DharmaFECT1 reagenssel (Dharmacon). A transzfekciót 24 óra után megismételtük. a sejteket további 24 órán keresztül tenyésztettük a teljes RNS extrakció vagy fixáció előtt. ON-TARGETplus emberi MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) használták leüt MARCKSL1. Az on-TARGETplus Non-target poolt (Dharmacon) használták kontroll siRNS transzfekcióként. A sejteket 4% PFA/PBS-sel rögzítettük, 0,1% Triton X-100-zal permeabilizáltuk, és 14 km dapi-val festettük a magok címkézésére, Alexa 568-falloidin (1:1000, Thermofisher Scientific) az F-aktin és az anti-ve-cadherin antitest (1:100, sejtjelzés) megjelenítésére, majd az anti-rabbit Alexa 488 másodlagos antitest (1:1000, Thermofisher Scientific) az EC csomópontok megjelölésére.
nyírófeszültségi kísérletekhez a HPAEC-et (Lonza) 1000-1500 sejt/mm2-en tenyésztettük 1% zselatinnal bevont edényen EGM-2 közegben (Lonza), és a 9.szakasz előtt használtuk. A sejteket statikus vagy lamináris nyírófeszültségnek tesszük ki 15 dyn/cm2-en 0,5, 1 vagy 6 órán keresztül egy párhuzamos lemez típusú készülék45,46 alkalmazásával. Az átfolyókamra egyik oldala egy 1% – os zselatinnal bevont üveglapból állt, amelyen a tenyésztett Hpaec-ek pihentek, a másik oldala pedig egy polikarbonát lemezből állt. Sík felületüket 200 km-re egymástól Teflon tömítéssel tartották. A kamra bejárattal és kijárattal volt ellátva a folyadék számára, a bejáratot pedig egy szilikoncsővel ellátott felső tartályhoz csatlakoztatták. A kijárat egy alsó tározó felé volt nyitva. Az áramlást egy henger/cső szivattyú hajtotta. A folyadék (EGM-2 közeg) a felső tartályból az áramlási kamrán keresztül az alsó tartályba jutott. Az áramlási sebességet a bejáratnál elhelyezett ultrahangos tranzit idő áramlásmérővel (HT107, Transonic Systems) ellenőriztük, és a felső tartály és az áramlási kamra kilépése közötti magasságkülönbség megváltoztatásával szabályoztuk. Az intenzitás a nyírási stressz (τ, dynes/cm2) ható EK réteg számítása a következő képlet alkalmazásával τ = 6µQ/a2b, ahol μ a viszkozitás a perfusate (tartás), Q az áramlás-térfogat (ml/s), majd egy b vagy a keresztmetszeti méretei az áramlási út (cm). A nyírási stressz expozíció után a teljes RNS-t izoláltuk a qPCR-re.
Kvantitatív valós idejű PCR: a qPCR-T 1 db 650 ng (HPAECs) vagy 500 ng (HUVECs) teljes RNS-ből előállított cDNS-ből 10 db 6x Luna univerzális QPCR mesterkeveréket (NEB) és 400 nM előre-és fordított primereket tartalmazó reakciókeverékben végeztük. A reakciókat ABI Prism 7900HT műszer négyszeres. Az adatokat az RQ Manager szoftver (Applied Biosystems) segítségével elemeztük, és a MARCKSL1 mRNS relatív expresszióját a 2−Onct Módszer47 alkalmazásával számítottuk ki gapdh mint referencia gén.
teljes mount in situ hibridizáció: A teljes mount in situ hibridizációt a standard protokoll szerint végeztük48. Az embriókat 4% PFA-ban rögzítettük 24, 48 és 72 hpf-en, és permeabilizáltuk 10 KB/mL proteináz K-val.a hibridizációt 5% nátrium-dextrán-szulfátot tartalmazó pufferben (MW = 500 kDa) végeztük 70 Kb-on egy éjszakán át. Szigorú mosás után a mintákat 2%-os blokkoló reagenssel (Roche) blokkoltuk maleinsav pufferben, és egy éjszakán át inkubáltuk anti-digoxigenin (DIG) antitesttel, amelyet alkalikus foszfatázzal (Roche, 1:5000) konjugáltunk 4 6c-n .az embriókat festőpufferben NBT/BCIP oldattal (Roche) festettük. Az embriókat 70% glicerinnel egy éjszakán át kitisztítottuk, és Leica M205FA mikroszkóppal lefényképeztük. A marcksl1a és marcksl1b DIG-jelölt 1.2 kb hosszú riboprobákat a teljes hosszúságú cDNS-eket kódoló plazmidokból állították elő MEGAscript SP6 vagy T7 készletek (Invitrogen) segítségével.
egysejtű RNS szekvenálás: az ECs-t TG(kdrl:EGFP)s843 transzgenikus embriókból izoláltuk. A sejtválogatást FACSAriaII Sejtválogatóval (BD Bioscience) végeztük. Az egycellás szuszpenziót betöltötték a 10x Chromium rendszerbe, és a cDNS könyvtárakat a Chromium Next GEM Single Cell 3′ GEM, a Library és a Gel Bead Kit v2 (10x genomika) felhasználásával építették fel a gyártó protokollja szerint. A könyvtárat a Illumina HiSeq 1500 szekvenszer (Illumina, USA). Cell Ranger v2.1 használták annak érdekében, hogy de-multiplex raw base call (BCL) fájlok által generált Illumina sequencers be FASTQ fájlokat, végre az igazítás, vonalkód számlálás, és UMI számlálás. A szekvenálási leolvasásokat a zebrafish Genom összeállításához (GRCz11, Ensembl 92.kiadás). További elemzéseket végeztünk a Seurat package49 in R szoftver használatával (https://www.r-project.org). Az expressziós mátrixokat először úgy szűrtük, hogy a legalább 3 sejtben expresszált géneket, valamint a legalább 200 gént expresszáló sejteket a downstream elemzéshez tartottuk. A sejteket tovább szűrtük olyan sejtek kiválasztásával, amelyek alacsony mitokondriális tartalmat (<7%) expresszálnak. Az adatokat ezután normalizeddata funkcióval normalizáltuk, amely normalizálja az egyes sejtek génexpresszióját a teljes expresszióval.
az erek átmérőjének mennyiségi meghatározása: élő Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 transzgenikus wildtype vagy marcksl1 mutáns embriókat képeztünk 50-52 hpf-en. Konfokális z-kötegeket szereztünk egy Olympus UPLSAPO 40++ / NA1.25 szilikonolaj merítési céllal. DA és PCV átmérő számításokhoz 4-5 mérést végeztünk az ISV-k között a sárgája-kiterjesztés mentén (ISVs no. 10-14). Az ISV átmérő esetében átlagosan 6 mérést végeztek minden ISV mentén (ISVs no. 10-14) A DA és a DLAV között. A méréseket Fidzsi-szigetek (NIH) segítségével végeztük.
az EK-szám és az elterjedés mennyiségi meghatározása: Az EC-szám megszámlálásához 52 hpf wildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 vagy marcksl1ark23;marcksl1brk24 embriókat TG-ben(kdr-l:ras-mCherry)s916 a hátteret 4% PFA-ban rögzítették, és 3 db dapi-val festették. A konfokális z-kötegeket Olympus UPLSAPO 40x / NA 1.25 szilikonolaj merítési céllal szereztük be. Az atommagokat minden ISV-ben (ISVs no. 9-22) megszámoltuk a DA és a DLAV között. Mitotikus ECs számszerűsítése ISV-kben, wildtype – ban vagy marcksl1ark23-ban;marcksl1brk24 embriók Tg-ben (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg(kdr-l:a RAS-mCherry)s916 hátterét 4% PFA-ban rögzítették 30, 36 és 48 hpf-en, 1% DMSO/1% Triton X-100-ban permeabilizálták, és anti-phospho H3 antitesttel (1:250, Merck Millipore) festették, majd anti-rabbit Alexa 488 szekunder antitesttel (1:1000, Thermofisher Scientific) és 3 db dapi-val festették. A konfokális z-kötegeket Olympus UPLSAPO 40x / NA 1.25 szilikonolaj merítési céllal szereztük be. A mitotikus sejteket (pH3-pozitív sejteket) ISV-kben számoltuk az embrió mindkét oldalán (ISVs no. 9-22). Az ISV-ket mcherry fluoreszcencia segítségével vizualizáltuk. ISV-nként csak egy pH3-pozitív sejtet detektáltunk, függetlenül az ISV helyzetétől. A számlálás során az EC-t telofázisban egyetlen sejtnek tekintettük. Az EK-felosztások számának megszámlálásához wildtype vagy marcksl1ark23; marcksl1brk24 embriók Tg-ben(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 hátteret 24-től 48 hpf-ig 6 perc intervallumokban képeztünk Olympus UPLSAPO 30 Kb/NA 1.05 szilikonolaj merítési cél. Az egyes ISV-k sejtosztódásának számát (ISVs no. 11-15) számszerűsítettük.
az aktomiozin szintek mennyiségi meghatározása az apikális kéregben: élő Tg (fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; A Tg(fli1ep:EGFP-Plc 60/na 1.2)rk26 és a Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 zebrafish embriókat 30-34 hpf-en képeztük Le Olympus UPLSAPO 60 6.2 VÍZIMERÍTÉSI objektív segítségével. A Lifeact vagy Myl9b intenzitását az apikális kéreg mentén és a citoplazmában Fiji-k segítségével mértük. Kiszámítottuk az átlagos kortikális és citoplazmatikus intenzitás arányát.
In vivo sejtalak elemzés: az ECS egysejtű címkézését ISV-kben a fli1ep:lysegfp plazmid mozaik expressziójával érték el wildtype, marcksl1brk24 vagy marcksl1ark23; marcksl1brk24 mutáns embriók vagy fli1ep:marcksl1b-EGFP plazmid wildtype embriókban. 2 dpf-nél mikroangiográfiát végeztünk, és az ereket Olympus UPLSAPO 60 ++ /NA 1,2 vízimmerziós objektívvel, 0,25 MHz-es optikai z sík intervallummal képeztük. Az ISV-k ECS-jének sejtalak-elemzését félig automatizált módon, Pythonban kifejlesztett egyedi írású ImageJ szkript segítségével végeztük, kiterjesztve a ref. 50. A képeket először durván kivágták, hogy csökkentsék a downstream memóriaigényt, és további metaadatokat (edénytípus és embrió azonosító) töltöttek fel. Ezután egy külön szkriptet futtattak a sejtek kivetítésére és kibontására egy edény körül egy 2D felületre. Röviden, a kivágott képeket először az edény típusa alapján forgattuk, hogy durván igazítsuk az edény tengelyét a Z irányhoz egy képkötegben, majd a fluoreszcens mozaikcella címkéjének csatornáját választottuk ki a vetítéshez. A változó fluoreszcens háttérstruktúrák és a dextrán-rodamin perfúziója által okozott automatikus érszegmentációval kapcsolatos problémák leküzdése érdekében a hajó tengelyét úgy azonosítottuk, hogy manuálisan meghatároztuk az ér helyzetét körülbelül minden 10 MHz-en keresztül a képkötegen keresztül, majd elvégeztünk egy Catmull-Rom spline illesztést és interpolációt. Az adatokat ezután átalakítottuk annak érdekében, hogy az edény tengelyét három dimenzióban kiegyenesítsük. Ezután a vetítőcsatornában a maximális intenzitás helyzetét sugarak mentén határoztuk meg az edény tengelye körül 1 db-os időközönként. Ezt az információt arra használták, hogy a fluoreszcencia intenzitását egy olyan síkra vetítsék, ahol a tengelyek az edény tengelye és szöghelyzete mentén helyezkednek el, és a vetített sík minden egyes helyzetében feltérképezzék a hajó tengelyétől való távolságot. A cellát a vetített kép alapján azonosították az ImageJ beépített Intermodes módszerével. Ezután kiszámítottuk a cellához társított egyes pixelek oldalai által képviselt ívhosszokat (\(l = \ frac{{2 \ pi rd^2}}{{360}}\), ahol r a cellához társított pixel és az edény tengelye közötti távolság, d pedig a pixel oldala), és a sejtfelszín és a képarány mérésére szolgál.
in vitro sejtalak analízis: a rögzített HUVECs-eket Olympus UPLSAPO 40 ++ /NA 1,25 szilikonolaj merítési objektívvel képeztük. Minden borítólapon 10-20 képet készítettek számszerűsítésre, majd félig automatizált módon elemezték egy egyedi írású ImageJ szkript segítségével. A többcsatornás z-stackeket maximálisan kivetítettük, és a GFP markert mutató csatornát a műszer metaadataiból azonosítottuk. Az ImageJ beépített Otsu küszöb módszerét használták az érdekes sejtek háttérből történő elválasztására; az így kapott bináris képeket 105-nél kisebb régiók eltávolításával tisztítottuk meg.6m2 valamint a látómező határával érintkező régiók. Egy későbbi kézi beavatkozási lépés lehetővé tette a felhasználó számára, hogy opcionálisan módosítsa az érdeklődésre számot tartó cellarégiókat ezen bináris kép alapján, hogy elkülönítse a hibásan egyesített cellákat, vagy olyan cellákat tartalmazzon, amelyeket a küszöbművelet elmulasztott. A szkript ezután kiszámította az egyes cellák ROI területeit és kerületeit. Ezenkívül minden cellára egy’ spikiness indexet ‘ számítottak ki a cellahatárnak a megfelelő konvex hajótest kerületéhez viszonyított aránya alapján, és a cella oldalarányának értékét a cella ROI-jához illesztett ellipszis fő-és kisebb tengelyeinek arányaként számították ki.
a membránfehérítés elemzése: a membránfehérítéssel kapcsolatos parcellákat félig automatizált módon, egyedi írású ImageJ szkript segítségével állítottuk elő. Minden egyes leképezett membrán esetében minden egyes időpontban kiszámítottuk a membránél kontúrhossza és az élvégpontok közötti euklideszi távolság arányát. A kapott idősorokból a teljesítményspektrális sűrűségeket Welch módszerével számítottuk ki51. A teljesítményspektrális sűrűséget ezután egy érdekes ablakra átlagoltuk, empirikusan meghatározva azt a jellegzetes időt, amely alatt a blebs képződött (0,04–0,06 Hz); ezeket az átlagolt értékeket összehasonlítottuk a kísérleti (Marksl1b túlexpresszió) és a kontroll körülmények között.
az aktin és a miozin II dinamikájának elemzése a blebs-ben: Az aktin vagy a miozin dinamikáját a blabbing sejtekben félautomatizált módon állították elő egy egyedi írású ImageJ szkript segítségével. A többcsatornás time-lapse z-stackeket először maximálisan vetítették ki a z dimenzió mentén. A szoftver ezután automatikusan azonosította a bleb szélét két felhasználó által definiált rögzítési pont között minden időpontban az ImageJ beépített Otsu küszöbérték-módszerével, amely a Marksl1b-EGFP csatornán fut, mint a membrán címkézésének helyettesítője. A bleb-él pontos azonosítását biztosító felhasználói minőségellenőrzési lépést követően az aktin / miozin-csatorna intenzitási profilt az él mentén minden egyes időpontban kivontuk, és az idő függvényében egy kymográf segítségével ábrázoltuk. Minden egyes időpontban az intenzitási statisztikákat kivontuk a bleb-területtel együtt, amelyet itt a Z-vetített területként határoztunk meg, amelyet az él és a bleb csúcsától legtávolabb eső két oldalán lévő pontokat összekötő vonal köt össze a felhasználó által meghatározott rögzítési pontokat összekötő vonal mentén, és az aktin/miozin csatorna átlagos intenzitását és a bleb-területet az idő függvényében ábrázoltuk.
a kérgi aktin sűrűségének és kötegszélességének mennyiségi meghatározása: A HUVECs-ben lévő aktin nagy felbontású képeit Plan-APOCHROMAT 63x oil objektívlencsével szerelték fel egy Zeiss lsm880 konfokális mikroszkópra, amely Airyscan és GaAsP detektorral volt felszerelve. Az egyes megfigyeléseken belül körülbelül 3 db négyzet alakú régiót véletlenszerűen választottunk ki, és jellemzően 8 optikai szakaszt vágtunk le, amelyek lefedik a kérgi hálót ezekből a régiókból. A kivágott halmok Z tengelye mentén vetített képeket maximális intenzitású vetítéssel állítottuk elő, és a következő eljárásnak vetettük alá. Mivel a képen belüli aktinszálak kétértelműek voltak, és lehetetlen volt a teljes hálózatot értékelni, számszerűsítettük az aktinszálak számát A korlátozott régiókban, mint az aktin háló sűrűségét. Ezt úgy hajtottuk végre, hogy az X – és Y – tengely mentén minden 4 pixelnél letapogatási vonalakat állítottunk be, és az egyes letapogatási vonalak mentén lévő pixelértékeket a Savitzky-Golay szűrőnek vetettük alá52 az elsőrendű deriváltak kiszámításához. Az aktinszálakat ezután nulla keresztezési pontok megtalálásával azonosítottuk, amelyek a letapogatási vonal intenzitási csúcsai. A csúcsok számát elosztottuk a beolvasási vonal pixelszámával (a kép szélessége vagy magassága), és az izzószálak sűrűségét a kép felett ezeknek az értékeknek az átlagával számítottuk ki.
az aktinköteg szélességének számszerűsítéséhez az aktinkötegek centrikus vonalait a Savitzky-Golay szűrővel kiszámított elsőrendű származékok nulla keresztezési pontjainak megkeresésével, majd a Hilditch ritkítási algoritmus alkalmazásával állítottuk elő. Annak elkerülése érdekében, hogy az aktinszálak elágazási vagy keresztezési pontjai befolyásolják a méréseket, a csontvázas vonalon belül található elágazási pontokat megszüntették és szegmentálták. A teljes szegmens ortogonális tengelyét a sajátvektor megszerzésével határoztuk meg, a fluoreszcens intenzitásokat pedig a szegmens gravitációs középpontját futtató ortogonális tengely mentén vettük fel a Lanczos-5 interpolációs módszerrel. Ezután az izzószál átmérőjét annak a tartománynak a szélessége határozta meg, amely nagyobb vagy egyenlő a csúcsintenzitás felével a teljes szegmensre merőleges tengely mentén mintavételezett vonalon belül.
statisztika: a statisztikai elemzést a Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). A minták méretét nem határozták meg előre, a kísérleteket nem randomizálták, és a vizsgálókat nem vakították el a kísérletek és az eredmények értékelése során.
jelentés összefoglaló
a kutatási tervezéssel kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.
