a Phaseolus vulgaris magokból származó aszparagináz tisztítása és jellemzése

absztrakt

baktériumokból származó L-aszparaginázt akut limfoblasztos leukémia kezelésére használták. A vizsgálat célja az volt, hogy az L-aszparaginázt a Phaseolus vulgaris magokból tisztítsák és jellemezzék mikrobiális források helyett. Az L-aszparaginázt látszólagos homogenitásig tisztítottuk. Az enzim molekulatömege 79 kDa. A tisztított aszparagináz nagyon alacsony aktivitást mutatott számos aszparagin és glutamin analóg felé. Az L-aszparagináz mentes volt a glutamináz aktivitástól. A tisztított enzim kinetikai paraméterei, Km, illetve Vmax értéke 6,72 mM, illetve 0,16 mm volt. Az enzim optimális pH-ja 8,0 volt. Az enzim nagy stabilitást mutatott lúgos pH-n (pH 7,5–9,0), amikor 24 órán át inkubáltuk. az L-aszparagináz ugyanolyan hőmérsékleti optimummal és hőstabilitással rendelkezett 37cc. k + képes volt nagymértékben növelni az aszparagináz aktivitását 150% – kal a többi vizsgált fémhez képest. Összefoglalva, az L-aszparagináz nem mutatott glutamináz aktivitást és jó stabilitást a fiziológiai állapotok széles körében, így potenciális jelöltként alkalmazható akut limfoblasztos leukémia kezelésére.

1. Bevezetés

az L-aszparaginázt (L-aszparagin amidohidroláz E. C. 3.5.1.1) akut limfoblasztos leukémia és non-Hodgkin limfóma kezelésére használják . Az L-aszparagináz rákellenes terápiában való alkalmazása azon a képességén alapul, hogy a limfoblasztok növekedéséhez nélkülözhetetlen aminosavat, az L-aszparagint ammóniává és L-aszparaginsavvá hasítja a szérumban és a cerebrospinális folyadékban, mivel a limfoblasztok nem képesek endogén L-aszparagint termelni, ami ezen sejtek halálához vezet . A rákos sejtek többsége ezen aminosav exogén forrásától függ a túlélés szempontjából. A normál sejtek azonban képesek szintetizálni az L-aszparagint, így kevésbé érinti őket az enzimmel történő kezelés miatt bekövetkező gyors kimerülése. Az L-aszparagináz felhasználható az akrilamid képződésének csökkentésére sült és kemencében szakácsolt ételekben, különösen a burgonya chipsben . Az akrilamid képződését a szabad aszparagin és a redukáló cukrok reakciójának tulajdonították . Az aszparagin aszparagináz általi depléciója megakadályozta az akrilamid képződését .

az L-aszparagináz széles körben elterjedt a növények, állatok és mikroorganizmusok között . A növényben ezt az enzimet először a Lupinus albus fejlődő magjaiban detektálták . Az aszparaginázt az L. polyphyllus érlelő magjainak testájából is megtisztították . Az enzim két formáját azonosították. A K+-függő forma megtalálható az L. arboreus és az L. polyphyllus fajokban, a K + – függő forma pedig a Pisum sativumban és számos más hüvelyes fajban, beleértve más Lupinus fajokat is . Az L. polyphyllus K+-független formája elleni antitestekkel végzett munka nem mutatott keresztreakciót sem a borsó aszparaginázzal, sem a Lupinus számos fajtájával, amelyek a K+-függő enzimet tartalmazzák, ami arra utal, hogy az aszparagináz két formája immunológiailag különbözik egymástól .

nagyon kevés információt jelentettek a növényi aszparagináz akut limfoblasztos leukémia kezelésében történő alkalmazásáról . Ezért a vizsgálat fő célja az volt, hogy megtisztítsa és jellemezze az L-aszparaginázt az L-glutamináztól mentes Phaseolus vulgaris magokból a mikrobiális forrásokból származó L-aszparagináz helyett, amelyet rákellenes szerként használnak, és immunológiai válaszai miatt mellékhatásokat okozott.

2. Anyag és módszerek

2.1. Növényi anyagok

érett magok a Phaseolus vulgaris cv – ből. A Giza 6-ot az egyiptomi Kairói mezőgazdasági Kutatóközpontból szerezték be.

2.2. Aszparagináz tisztítása

2.2.1. Nyers kivonat

az aszparagináz nyers kivonatát 50 g Phaseolus vulgaris cv mag homogenizálásával állítottuk elő. Giza 6 20 mM-es trisz-HCl pufferben, pH-ja 8,0, amely 10% glicerint, 50 mM KCl-t, 12,5 mM-etanol-merkapto-etanolt és 1 mM PMSF-et tartalmaz. A homogenizátumot 10 000 g-on centrifugáltuk, és a felülúszót nyers extraktumként jelöltük. A nyers kivonatot dialízissel koncentráltuk szilárd szacharóz ellen.

2.2.2. DEAE-Sepharose oszlop

koncentrált nyers kivonatot vittünk fel egy DEAE-Sepharose oszlopra (15 6 cm i.d.), amelyet előzőleg 20 mM-es trisz-HCl pufferrel egyensúlyba hoztunk, pH 8,0. Az enzimet az azonos pufferben 60 mL/h áramlási sebességgel előállított KCl különböző koncentrációival eluáltuk, és 3 mL frakciót gyűjtöttünk össze. A fehérje három csúcsát eluáltuk aszparagináz aktivitással az elúciós sorrend szerint (I., II.és III. aszparaginázok).

2.2.3. Szefakrilsz-200

a legnagyobb aktivitású aszparagináz-I-t egy Szefakrilsz-S-200 oszlopra helyeztük (90 ons 0.6 cm i.d.), amelyet előzőleg ugyanezzel a pufferrel 30 mL/h áramlási sebességgel egyensúlyba hoztunk, és 3 mL frakciót gyűjtöttünk össze.

2.3. Aszparagináz Assay

az L-aszparagináz aktivitását wriston módosított módszerével mértük . Az L-aszparagináz katalizálja az L-aszparagint L-aszparaginsavvá és ammóniává, az utóbbi pedig Nessler reagensével reagálva narancssárga színű terméket állít elő. Az enzimvizsgálati elegy 900 ml frissen elkészített L-aszparagint (20 mM) tartalmazott 50 mM-es trisz-HCl pufferben (pH 8,0), 50 mM KCl-t és 100 ml nyers enzimkivonatot. A reakcióelegyet 37cc-on 30 percen át inkubáltuk, majd a reakciót 100cl 15% – os triklór-ecetsav hozzáadásával leállítottuk. A reakcióelegyet 10 000g-n centrifugáltuk 5 percig 4C-N, hogy eltávolítsuk a csapadékot. A felülúszóban felszabaduló ammóniát kolorimetriás módszerrel határoztuk meg úgy, hogy 100 6L Nessler-reagenst adtunk a 100 ml felülúszót és 800 ml desztillált vizet tartalmazó mintához. A minta tartalmát vortexeltük és szobahőmérsékleten inkubáltuk 10 percig, majd az OD-t 425 nm-en mértük. A reakcióban előállított ammóniát az ammónium-szulfáttal kapott standard görbe alapján határoztuk meg. Az L-aszparagináz aktivitás egy egysége annak az enzimnek a mennyisége, amely percenként 1 db ammóniát szabadít fel 37 dB C.

2.4. A fehérje meghatározása

a fehérjét Bradford módszerrel, standard szarvasmarha szérum albuminnal határoztuk meg.

2.5. Molekulatömeg meghatározása

a natív molekulatömeget Sephacryl S-200-mal határoztuk meg. Az oszlopot citokróm C-vel (12 400), szén-anhidrázzal (29 000), szarvasmarha-szérumalbuminnal (67 000), alkohol-dehidrogenázzal (150 000) és 600 000-amilázzal (200 000) kalibráltuk. Dextránkék (2 000 000) használtuk az üresség térfogatának (Vo) meghatározására. Az alegység molekulatömegét SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel becsülték meg . A kalibrációs görbéhez SDS-denaturált foszforiláz-b-t (94 000), szarvasmarha-szérumalbumint (67 000), ovalbumint (43 000), szén-anhidrázt (30 000), szójabab-tripszin-inhibitort (20 000) és Ca-laktalbumint (14 200) használtunk.

2.6. Az aszparagináz jellemzése

2.6.1. A szubsztrát specificitást

Az aszparagináz aktivitást az L-aszparagin néhány analógjával határoztuk meg. A relatív aktivitást az enzimaktivitás százalékos arányában fejeztük ki, amelyet az L-aszparagin különböző szerkezeti analógjai alapján határoztunk meg az L-aszparagin enzimaktivitásához viszonyítva.

2.6.2. Kinetikai paraméterek

a Michaelis-állandók (Km) és a maximális sebesség (Vmax) értékeit l-aszparagin szubsztrátként 2-20 mM-es tartományban határoztuk meg. a kinetikai paramétereket Lineeweaver-Burk parcella alapján határoztuk meg.

2.6.3. A pH hatása

az aszparagináz aktivitás optimális pH-ját az aktivitás különböző pH-értékeken történő vizsgálatával határoztuk meg. A pH-stabilitást úgy vizsgáltuk, hogy az enzimet 5,0–9,0 pH-n 24 órán át inkubáltuk 4CC-n szubsztrát nélkül, a maradék aktivitást pedig a standard vizsgálati körülmények között határoztuk meg.

2.6.4. A hőmérséklet hatása

az aszparagináz aktivitás optimális hőmérsékletét az enzim különböző hőmérsékleteken történő vizsgálatával határoztuk meg. A hőstabilitást úgy mértük, hogy az enzimet önmagában inkubáltuk különböző hőmérsékleteken 1 órán át. hőkezelés után az enzimoldatot lehűtöttük, majd a szubsztrátok hozzáadása után megvizsgáltuk a maradék aktivitást.

2.6.5. Fémion hatás

a különböző fémionok enzimaktivitásra gyakorolt hatását úgy határoztuk meg, hogy az enzimet önmagában 10 mM-es fémionokkal 15 percig előinkubáltuk a szubsztrát hozzáadása előtt. A fémionok hiányában vizsgált aktivitást 100% – nak vettük.

3. Eredmények és megbeszélés

a P. vulgaris aszparagináz tisztítási lépéseinek eredményeit az 1.táblázat foglalja össze. A DEAE-Szefaróz oszlopon végzett kromatográfia elúciós profilja (1.ábra) három aszparagináz aktivitású fehérje csúcsot mutatott. A legmagasabb aszparagináz aktivitású első csúcsot egy Sephacryl S-200 oszlopra alkalmazták (2.ábra). Az L-aszparagináz I-t 21,7-szeresére tisztítottuk 846 egység/mg fehérje specifikus aktivitással. Az aszparagináz i a Sephacryl S-200 oszlop után tisztának bizonyult az SDS-PAGE értékelése szerint (3.ábra). Az aszparagináz I molekulatömege a Sefacryl S-200 és az SDS-PAGE eljárásokkal 79 kDa monomer alegységet eredményezett. Ez a megállapítás megegyezik a Vigna unguiculata (70 kDa) és a Lupinus polyphyllus (75 kDa) aszparaginázok molekulatömegével . 58 kDa közepes molekulatömegű aszparaginázt detektáltunk a borsólevélből . Bakteriális aszparaginázok esetében a molekulatömeg 140-160 kDa volt tetramer alegységekkel . A Streptobacillus sp esetében nagyon alacsony, 11,2 kDa molekulatömeget detektáltunk. KK2S4 aszparagináz .

ábra 1

a P. vulgaris-ból származó aszparagináz KROMATOGRÁFIÁJÁNAK tipikus elúciós profilja a DEAE-Sepharose oszlopon (15 .. 1,6 cm i.d.) előzőleg 20 mM-es Tris-HCl pufferrel egyensúlyban, pH 8,0, 60 mL/h áramlási sebességgel és 3 mL frakcióval.

ábra 2

aszparagináz I Gélszűrése DEAE-Szefaróz frakcióból a Szefakrils-S-200 oszlopon (90 6 cm / nap). Az oszlopot 20 mM-es Tris-HCl pufferrel egyensúlyba hoztuk, pH-ja 8,0 volt, 30 mL/óra áramlási sebességgel és 3 mL frakciókkal.

ábra 3

SDS-oldal a Phaseolus vulgaris aszparagináz I homogenitásának és molekulatömegének meghatározására. (1) fehérje markerek; (2) Szefakrilsz-S-200 aszparagináz I.

az aszparagináz I szubsztrát specificitását számos aszparagin és glutamin analóg alkalmazásával vizsgálták (2.táblázat). Az L-aszparaginnal végzett aktivitást 100% – os aktivitásnak tekintették. A DL-aszparagin az enzimaktivitás 30%-át mutatta, ahol a DL-aszparagin egy 1 : 1 racém keverék. A D-aszparagin, az L-aszparaginsav és az L-glutaminsav analógok aktivitása nagyon alacsony volt az aszparagináz I-vel szemben.L-glutamin jelenlétében nem észleltek aktivitást. Ezért a P. vulgaris-ból származó aszparagináz I mentes a glutamináztól. Az aszparagináz glutamináz aktivitással való szennyeződése mellékhatásokat okozott a rákellenes kezelés során . Az L. arboreus aszparagináz csak az L-aszparagint és a DL-aszpartil-hidroxamátot hidrolizálta . A V. unguiculata aszparagináz specifikus volt az L-aszparaginra, nem hidrolizálta a D-aszparagint, és nem volt specifikus az L-glutaminra .

a tisztított enzim kinetikai paraméterei, Km és Vmax értéke 6,72 mM aszparagin és 0,16 mm ammónia/mL volt (4. ábra). Az L. arboreus és L. angustifolius aszparaginázok esetében hasonló, 6,6 és 7,0 mM-es Km-értékeket határoztak meg . A Lupinus magokból származó aszparagináz magas Km-rel rendelkezik az aszparagin esetében (12,2 mM) . Alacsony Km (1.2 mM) az aszparaginázt V. unguiculata-ból határoztuk meg . A baktériumok esetében az Escherichia coli és az Erwinia carotovora L-aszparagináz Km-értéke 3,5 mM, illetve 7,14 mM volt .

ábra 4

Lineweaver-Burk diagram az aszparagináz I-ről a P. vulgaris sebességétől a különböző L-aszparagin koncentrációig.

Az aszparagináz I pH-értéke 8,0 (5.ábra). A pH 6,0 és 9,0 között aktivitásának több mint 50% – a megmaradt. Bár a fiziológiás pH-nál a maximális aktivitás az L-aszparagináz egyik előfeltétele a tumorellenes aktivitáshoz, a tisztított enzim hasznos lenne, mivel az enzimaktivitás 80% – a 7,5 pH-n maradt. Az enzim stabilitást mutatott lúgos pH-n (pH 7,5–9,0), mivel eredeti aktivitásának 90% – át megtartotta 24 órán át inkubálva (6.ábra). Az L-aszparaginázok pH-optimuma azonban több növényből 8,0-8,5 között mozgott . A baktériumokból származó L-aszparaginázok többsége lúgos pH–optimát mutatott (8,0-10) .

ábra 5

az aszparagináz I pH-optimuma a P. vulgaris – tól. Az enzimaktivitást különböző pH-értékeken mértük a korábban leírt standard vizsgálati módszerrel.

ábra 6

az aszparagináz i pH-stabilitása a P. vulgaris-tól különböző pH-n inkubálás után 24 h-nál 4CC-nél.

Az aszparagináz I hőmérsékletének optimumát 37cc-nél állapították meg (7.ábra). Az aszparagináz hasonló hőmérsékleti optimumát jelentették a V. unguiculata – ból (40 C). Ez a hőmérséklet szintén hasonló volt a Pseudomonas aeruginosa és a Pectobacterium carotovorum esetében jelentett hőmérséklethez . A Streptobacillus sp optimális aktivitása. az aszparaginázt 35 6c-on jegyezték fel . Ellenkezőleg, a Chrombacteriaceae-ból és a Proteus vulgaris-ból származó l-aszparaginázt 20, illetve 57, a C-ből pedig 57, a C-ből figyelték meg . Nemlineáris összefüggést mutattak ki az aszparagináz I és a hőmérséklet stabilitása között (8.ábra). Az enzimaktivitás 37C-ig stabil volt inkubálás után 1 órán át. aszparagináz V-ből. az unguiculata 40-ig stabil voltcc inkubálás után 15 percig . A P. carotovorum és a C. annuum aszparaginázai megtartották kezdeti aktivitásukat 40, illetve 45, 60 percig tartó inkubálás után .

ábra 7

Az aszparagináz I hőmérsékleti optimuma a P. vulgaris – tól. Az enzimaktivitást különböző hőmérsékleteken mértük a korábban leírt standard vizsgálati módszerrel.

ábra 8

Az aszparagináz I termikus stabilitása a P. vulgaris – tól. A reakcióelegyet a szubsztrát hozzáadása előtt 60 percig különböző hőmérsékleteken előinkubáltuk, majd jégfürdőben hűtöttük. Az enzimaktivitást a korábban leírt standard vizsgálati módszerrel mértük. A nulla idejű aktivitást 100% – os aktivitásnak vettük.

megvizsgáltuk a különböző fémionok hatását az aszparagináz I – re (3.táblázat). A fémionokat 10 mM-es koncentrációban használtuk. a K + 150% – kal képes volt nagymértékben növelni az aszparagináz I aktivitását. Növényben K + – független és K+-függő aszparaginázokat azonosítottak . A K+ a P. carotovorum aszparagináz fokozójaként is működött . A Ca2+ enyhén, 110% – kal növelte az aktivitást, de a Cu2+ enyhén gátolta az aszparagináz I aktivitását .ezenkívül a Pb2+ és a Hg2+ részben gátló hatást váltott ki az aszparagináz I-re. a V. unguiculata aszparaginázt azonban a Ni2+ és a Co2+ aktiválta, és az Mn2+, a Zn2+, a Ba2+ és a Hg2 + gátolta. Az EDTA, mint fém kelátképző szer, részben gátló hatást fejtett ki az aszparagináz I-re .az EDTA azonban nem volt hatással a P. carotovorum aszparaginázra.

4. Következtetések

a P. vulgaris L-aszparagináz I-jét glutaminázmentes formában tisztítottuk, ami csökkentheti a mellékhatások lehetőségét a rákellenes terápia során. Az enzim jó stabilitást mutatott a fiziológiai körülmények széles skáláján, mint a pH és a hőmérséklet. Projektünk következő lépésében a P. vulgaris L-aszparagináz I-jét potenciális jelöltként használják akut limfoblasztos leukémia kezelésére.

összeférhetetlenség

a szerzők nem összeférhetetlenség releváns ez a papír nyilvánosságra.

elismerések

ezt a projektet a Nemzeti Tudományos, Technológiai és innovációs terv (Maarifah) finanszírozta, Abdulaziz Király tudományos és technológiai városa, Szaúd-Arábia, award no. (11-BIO-1516-03). A szerzők köszönetet mondanak a tudományos és technológiai egységnek, a King Abdulaziz Egyetemnek a technikai támogatásért.