Bevezetés
a biotechnológia mikroorganizmusokat, valamint magasabb szintű sejteket és azok hatóanyagait alkalmazza azzal a céllal, hogy különböző szubsztrátok kívánatos átalakulását érje el (Tripathi et al., 1997). Az L-fenil-acetil-karbinol az L-efedrin hidro-klorid és pszeudo-efedrin gyógyszerészeti vegyületek kémiai szintézisének kiindulási anyaga, amelyet dekongesztánsként, antiasztmatikumként használnak (Shin and Rogers, 1995), és a közelmúltban jelentették, az elhízás elleni védekezésben használják (Astrup et al., 1992). Az aromás szubsztrát benzaldehid biotranszformációs módszerrel L-PAC-ot ad. Bizonyos élesztőtörzsek piruvát-dekaroxiláz (PDC) és alkhol-dehidrogenáz (ADH) enzimekkel rendelkeznek, amelyek BENZALDEHIDBŐL l-PAC-ot és benzil-alkoholt termelnek (Nikolova és Ward, 1991). Biotranszformációs potenciálok a növekvő sejtek szabad betakarított sejtek immobilizált sejtek és izolált nyers, valamint tisztított enzim Bee n alaposan tanulmányozták (Liew et al., 1995; Shin és Rogers, 1996a, b).
az új törzsek szerepe a biokonverzióban fontos szempont. Az L-PAC termelést a Saccharomyces cerevisiae szabad és immobilizált sejtjein vizsgálták különböző növekedési és biotranszformációs körülmények között. De tanulmányoztuk az L-PAC termelését benzaldehidből különböző új törzsek alkalmazásával, különböző növekedési és biotranszformációs modalitások mellett, annak érdekében, hogy figyelemmel kísérjük az ideális körülményeket, amelyek lehetővé teszik a maximális termékhozamot állandó szubsztrátkoncentráció és sejtsűrűség mellett. Az L-PAC termelést az 1. séma tartalmazza.
| 1. séma: | |
anyagok és módszerek
az L-fenil-acetil-karbinol előállítása a Sccharomuces Cerevisiae normál sejtjeivel (BY)
az L-Pac (sok gyógyszer kulcsfontosságú köztiterméke) előállítása benzaldehidből élesztők által a fermentációs iparban az efedrin és más gyógyszerek előállításának lehetséges útja. Jelen tanulmányt a szerző a Sultan-Ul-Uloom gyógyszerészeti Főiskolán végezte, amely Hyderabadban, Indiában található 2004-ben.A sütőélesztő törzskultúráját frissen szubkulturáltuk (Ellaiah and Krishna, 1987) friss, steril Yema közepes ferdén, és szobahőmérsékleten inkubáltuk (kb. 28 db C) 36 órán át. így a 36 órás tenyészetet használtuk a betakarításhoz. A pékek élesztőjének tenyészetét 5 mL steril vízben rázással szüreteltük. A betakarított mikrobiális szuszpenziót átvittük inokulum közegbe-I. az inokulum közeg összetétele a következő:
a lombikot 28 6c-on inkubáltuk forgó rázógépen (180 fordulat / perc) 24 órán át.
a mikrobiális számlálást Neubauer számlálókamra alkalmazásával végeztük. A mikrobiális szuszpenziót úgy hígítottuk, hogy a szuszpenzió minden mL-je 200×106 sejtet tartalmazzon. Tíz milliliter inokulum az IM-I-ből 100 mL inokulációs közegbe került-II who összetétele az alábbiakban látható:
a lombikokat rotációs rázógépen (180 fordulat / perc) inkubáltuk 16 órán keresztül.
száz milliliter termelési közeget készítettünk. A vizsgálat nagy részében termelési közegként melasz közeget, valamint összehasonlító vizsgálat céljából cukornádlé közeget karbamiddal használtunk termelési közegként. Az IM-II-ből származó tíz milliliter oltóanyagot az IM-II-vel azonos összetételű táptalajra helyeztük, és 9 órán át inkubáltuk rotációs rázógépen. 9 óra elteltével tápanyagot (20 mL 50% – os melaszt) adtunk a melasztermelő közeghez, illetve tápanyagot (20 mL 50% – os cukornádlevet) adtunk a cukornádtermelő közeghez, és rotációs rázógépen inkubáltuk. – Tól 10 h – tól 0.A desztillált benzaldehid 6% – át 6 félórás időközönként elosztva adtuk a termelési közeghez.
ezután a lombikokat 24 órán át inkubáltuk a forgó rázógépen. a 130 mL táptalajt (azaz 100 mL termelőközeget+10 mL inokulumot+20 mL tápközeget) tartalmazó lombikokat 130 mL benzollal (oldószerrel) kezeltük,majd elválasztó tölcsérekben l5 percig ráztuk. Ezután a szerves réteget elválasztottuk, és abszorbens pamuton szűrtük át. Végül az oldószeres benzolt desztilláltuk, hogy L-PAC terméket kapjunk.
L-fenil-acetil-karbinol előállítása élesztők új Izolátumaival:
Biokonverziós eljárások:
összehasonlító vizsgálatokban az új tenyészeteket használták fel biotranszformációs potenciáljuk becslésére és összehasonlítására a pékek élesztőjével. A Candida pseudointermedia MTCC no.6225, Candida pseudountermedia MTCC no. 6352 és Issatchenkia orientalis MTCC no. 6351 törzskultúrákat aszeptikusan szubkulturáltuk Strile YEMA ferdén, sterilizált transzferhurokkal a steril területen (lamináris légáramlás).
a korábban említett eljárást (Ellaiah and Krishna, 1987) megismételték az új törzsek esetében is. A legtöbb vizsgálatban melasz közeget használtak termelési közegként, az összehasonlító vizsgálathoz pedig cukornádlé közeget karbamiddal (Kaur and Kocher, 2002) használtak termelési közegként.
eredmények és megbeszélés
az L-fenil-acetil-karbinol sárga színű folyadék. A jelentett fajsúly 0,93 szobahőmérsékleten. Az izolátumok, köztük a pék élesztők (S. cerevisia) által előállított L-PAC fajsúlya azonos volt. az L-PAC pH-értéke (az L-PAC minta és a víz 1: 1 aránya) 3,84. Ebben a kísérletben az L-PAC termék, amelyet négy különböző élesztővel, például pék élesztővel, a Candida pseudointermedia (6225), a Candida pseudointermedia (6352) és az Issatchenkia orientients (6351) biotranszformációjával nyertek, azonos pH-értékeket mutatott. Az L-PAC Rf értékét (Groger and Erge, 1965) kloroformban jelentették, mivel szilikagél Jódgőzöket használtak a foltok kimutatására.
a fejlődő kromatogramok kloroform, mint a front oldószer összehasonlítottuk oldószer keverék (30% etil-acetát 70% hexán), mint a mobil fázis. A későbbi oldószerfront jobb elválasztást mutatott, mint a kloroform. Tehát minden kísérletünkben 30% etil-acetátot és 70% hexánt használtunk oldószerként.
az L-PAC reakcióképes UV-fényben, jódgőzökben és a CA-metoxinaftalin elszenesedésében is. A standard L-PAC Rf értéke 0,33 körül van. A különböző izolátumok L-PAC terméke ugyanazt az Rf értéket mutatta.
az L-PAC-ban jelen lévő metil-keton idoform reakción megy keresztül (Smith and Hendlin, 1954). Kezdetben halogénezésen megy keresztül, majd a hasítás lúgok, például NaOH jelenlétében Idoformot eredményez. Ez a reakció nagyon specifikus az L-PAC esetében, és melléktermékeknél nem fordul elő. A különböző izolátumok által termelt L-PAC Idoformot eredményezett.
polarimetriás és kolorimetriás becslésekkel a százalékos biokonverziót különböző élesztő izolátumokban becsülték meg. Más fermentációs termékeket (pl. benzil-alkoholt, benzoesavat, valamint nem átalakított benzaldehidet) nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) és gázkromatográfiával (GC) vizsgáltunk. Az L-PAC kémiai szerkezetét azonosították és megfeleltek az 1H NMR és UV spektrális adatoknak.
több munkavállaló (Ellaiah and Krishna, 1987) fermentációt végzett melaszban termelési közegként, amellett, hogy az iparban melasz közeget használnak biokonverziós reakcióhoz az L-PAC termelésben.
ebben a vizsgálatban a cukornádlét próbáltuk l-PAC gyártás során termelési közegként használni. 0,25% karbamidot tartalmazó cukornádlevet használtunk termelési közegként, amely több L-PAC terméket eredményezett, mint melasz. Amellett, hogy a termék kivonása cukornád lé közeg nagyon kényelmes volt, mint a melasz közeg. A különböző élesztőizolátumokkal kapott % – os biokonverziót az 1.táblázat mutatja.
a sütőélesztő (S. cerevisiae) szabad sejtjeinek biotranszformációs potenciálját mind melaszban, mind cukornádlében, mint termelési közegben vizsgálták. A melasz közegben 25% – os biokonverziót figyeltek meg, ahol a cukornádlé közegben 28% – os biokonverziót figyeltek meg.
| 1. táblázat: | melasz és cukornádlé átalakítása l-PAC előállítása során termelési közegként |
a Candida pseudointermedia MTCC no.6225 szabad sejtjeinek biotranszformációs potenciálját mind melaszban, mind cukornádlében, mint termelési közegben vizsgálták. Melaszban 23,43% – os biokonverziót figyeltek meg, ahol a cukornádlé közegéhez hasonlóan 23,75% – os biokonverziót figyeltek meg.
a Candida pseudointermedia MTCC szabad sejtjeinek biotranszformációs potenciálja. A 6352-et mind melaszban, mind cukornádlében, mint termelési közegben vizsgálták. Melaszban 33,47% – os biokonverziót figyeltek meg, ahol a cukornádlé táptalajához hasonlóan 48,76% – os biokonverziót figyeltek meg.
az ISSATCHENKIA orientalis MTCC no.6351 szabad sejtjeinek biotranszformációs potenciálját mind melaszban, mind cukornádlében, mint termelési közegben vizsgálták. Melaszban 37,16% – os biokonverziót figyeltek meg, ahol a cukornádlé táptalajhoz hasonlóan 60,61% – os biokonverziót figyeltek meg.
következtetés
következtetésként a természetes forrásokból származó új élesztőtörzsek biotranszformációs vizsgálatokhoz történő felhasználására vonatkozó jelenlegi eljárást vizsgáltuk és használtuk a benzaldehid L-PAC-vá történő biokonverziójára. Három törzset izoláltak különböző természetes forrásokból, mint a feketeszőlő, a datolyagyümölcs és a cukornádlé, és azonosították a Chandigarh mikrobiális Technológiai Intézetben. Ezt a három törzset jelöltük Candida pseudointermedia MTCC no.6225 (BGY), Issatchenkia orientials MTCC no. 6351 (DY), Candida pseudointermedia MTCC no. 6352 (SCY).Ami fontos kiegészítés lesz a jelenlegi meglévő eljárásokhoz. A jelen kutatás legjelentősebb megállapításai 3 új élesztőtörzs felhasználása az L-PAC előállításához, valamint cukornádlé felhasználása az L-PAC előállításához termelési közegként. Mindkét kísérletben sikeresek vagyunk, és jelentősen megnő az L-L-PAC százalékos hozama, amikor cukornádlevet használtak termelési közegként. Bár a cukornádlé drága a melaszhoz képest, az extrakciós eljárás sokkal könnyebbnek bizonyult a cukornádlével a melaszhoz képest. További kutatási módok, például különböző tényezők, immobilizációs vizsgálatok, mutációs vizsgálatok stb., segíthet az L-PAC előállításának költséghatékony módszereinek megállapításában a cukornádlé termelési közegként történő felhasználásával. Ez az első jelentés a Candida pseudointermedia és az issatchenkia orientalis használatáról a benzaldehid L-PAC-ra történő biokonverziós vizsgálatához. A cukornádlé termelési közegként történő felhasználása a benzaldehid L-PAC-ba történő biotranszformációs vizsgálataiban szintén az első ilyen jellegű jelentés. Ezenkívül a cukornádlé megnövekedett biokonverziós potenciált mutatott, mint a melasz közeg. Az új törzsek tudjuk felfedezni a különböző kémiai reakciók. További tanulmányok folynak ebben az irányban.
Köszönetnyilvánítás
a szerzők hálásak az IMTECH-nek, Chandigarh-nak az új törzsek azonosításáért és az MTCC-számok hozzárendeléséért.
