a DBE technikával szisztematikusan gyűjtöttünk biopsziákat a teljes emberi béltraktusból, és jellemeztük az enteroendokrin K és L sejtek eloszlását, valamint hormontermékeik expresszióját egészséges egyénekben és 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő egyénekben.
mivel a 2-es típusú cukorbetegség túlsúlyt/elhízást és diszfunkcionális glükóz homeosztázist jelent, amely korrelálhat az enteroendokrin K és L sejtek változásaival, a vizsgálatot úgy tervezték, hogy leírja e sejtek eloszlási mintázatát és egyes termékeik expresszióját a két prospektív módon toborzott, hasonló méretű, jól meghatározott és egyező önkéntescsoportban, ismert gyomor-bélrendszeri rendellenességek nélkül. A DBE használatával nagy számú mintát lehetett beszerezni a bélrendszerben: kilenc anatómiailag specifikus régióból (ábra. 1) és 7-22 állomás a jejunum és az ileum mentén. Az anatómiailag jól meghatározott területek biopsziái nagyon összehasonlíthatók voltak. Nagyobb bizonytalanság áll fenn a jejunum és a proximális ileum biopsziás helyeit illetően (biopsziás helyek 3-9, ábra. 1) az intubáció változó hossza, így az egyének között kapott minták száma miatt. Ennek a kérdésnek a kezelésére szisztematikusan hét régióra osztottuk a jejunumot és az ileumot (lásd a módszereket). Az anterográd enteroszkópia során a maximális behelyezési mélységbe helyezett submucosalis tintajelet retrográd enteroszkópia során 24 egyénből négynél észlelték, jelezve a teljes enteroszkópiát (ábra. 2). Feltételezzük, hogy a béltraktus többségét a többi résztvevőnél megvizsgálták az elért intubáció hossza alapján (a részletekért lásd módszertani cikkünket ).
immunhisztokémiát és sejtszámot használtunk az enteroendokrin sejtek és a prohormon-feldolgozó enzimek számszerűsítésére, valamint a QPCR mRNS expressziós elemzést a hormonális/enzimatikus termékek értékelésére. Mindkét módszer jól bevált, de korlátozásokat is jelent. Az immunhisztokémiában alkalmazott antitestek magas specifitása nagy jelentőséggel bír a nem specifikus festés (hamis pozitív eredmények) minimális biztosítása érdekében. Ennek megfelelően jól megalapozott és jól jellemzett antitesteket választottunk . A szeletelt biopsziák mikrofotográfiáiból származó immunhisztokémia és sejtszám felhasználásával háromdimenziós tárgyakat (azaz enteroendokrin sejteket) értékelünk kétdimenziós képalkotó technikával. A sejteloszlás értékelésének optimálisabb technikája a sztereológia lenne ,amelyben a valódi sűrűség (azaz sejtek/mm3 Szövet) becsült. Ez a technika azonban teljes Transzverzális szövetblokkokat igényelne, ami összeegyeztethetetlen a biopsziás helyek nagy számával, és így az élő emberek bélrendszerének részletes feltérképezésével, amelyet a jelen tanulmányban céloztak meg. Ezenkívül a következőket kell figyelembe venni. Először is, az mRNS expressziójának értékelése jelzi az endokrin sejtek aktivitását, de nem adja meg egy bizonyos sejttermék teljes termelésének mértékét, mivel nem minden mRNS alakul át végső aktív termékké. Másodszor, az expresszió relatív, mivel a specifikus mRNS átiratok kapcsolatban állnak egy stabilan expresszált gén expressziójával (lásd ESM módszerek további részletekért). Figyelembe véve a 2-es típusú cukorbetegség biológiai heterogenitását, a nagyobb mintamérettel és a kiterjedtebb glükóz diszregulációval rendelkező betegek bevonásával potenciálisan kifejezettebb különbségeket lehetett volna kimutatni.
az enteroendokrin sejtek eloszlásáról szóló 1983-as munkája az eddigi legrészletesebb az emberi bélben az IHS alkalmazásával, széles körű antiszérummal (25 típus) az ismert vagy javasolt bél neurohormonális peptidekkel szemben . A minimálisan invazív technikák abban az időben nem álltak rendelkezésre. Ennek megfelelően a mintákat csak hét régióból vették ki: proximális és disztális duodenum, mid-jejunum, distalis ileum, emelkedő vastagbél, a keresztirányú vastagbél disztális része vagy szigmabél és végbél. Minden régió esetében 9-17 egyedből nyert szöveti anyagot. A mintákat vagy hasi műtét során (elsősorban rosszindulatú daganat miatt), vagy enteroszkópos vizsgálatok során vették ki biopsziákkal olyan egyéneknél, akiknek egyéb emésztőrendszeri rendellenességeik vannak, beleértve számos meghatározatlan tünetet és betegséget (pl. okkult vérzés és májbetegség). 1985-ben Adrian és munkatársai radioimmunoassay technikát alkalmaztak a PYY mennyiségének meghatározására a gyomor fundusban és az antrumban, a duodenumban, a jejunumban, az ileumban, a növekvő vastagbélben, a sigmoid vastagbélben és a végbélben . Az egyes helyekről származó mintákat 5-8 személytől kaptuk, akik karcinóma vagy gyomorfekély miatt műtéten estek át. 1992-ben az enteroendokrin L-sejtek emberben történő eloszlását vizsgáló tanulmányról Eissele et al . A mintákat hét régióból vették: duodenum, proximális és distalis jejunum, ileum, emelkedő vastagbél, keresztirányú vastagbél és végbél. A mintákat csak öt résztvevőtől nyerték, akik karcinóma vagy Crohn-betegség miatt műtéten estek át. 2005-ben Guedes et al A Gip-, GLP-1 – és CgA-pozitív sejtek eloszlását vizsgálta, IHS-t használva a vékonybél minden 20 cm-es mintáján 30 emberi tetemben .
hangsúlyozni kell, hogy a fent említett négy vizsgálat normálisnak tűnő szövetmintákat vizsgált, patológiás változások jele nélkül. Azonban a rosszindulatú vagy gyulladásos elváltozások jelenléte a bél területén vagy a sejtpusztulás gyors megkezdése a post mortem után befolyásolhatta az enteroendokrin sejtek általános eloszlását és működését. Ezenkívül a résztvevők heterogenitása befolyásolhatta az eredményeket.
eredményeinkkel egyetértésben SJ Xhamsterlund és mtsai, Eissele és mtsai, Adrian és Guedes et al, illetve leírták az L-sejt termékek (GLP-1 és/vagy PYY) variációját a bél lokalizációjától függően, nagyobb sűrűséggel/mennyiséggel a disztális jejunumban és az ileumban a duodenumhoz és a proximális jejunumhoz képest, és növekvő sűrűséggel/mennyiséggel a proximálistól a disztális vastagbélig, a legmagasabb szintekkel a végbélben . Eredményeink alátámasztják ezt az L-sejt eloszlási mintát egészséges egyénekben és a 2-es típusú cukorbetegségben, a GCG és a PYY gén expressziójának növekedésével, valamint a GLP-1 és a PYY-pozitív sejtek sűrűségének növekedésével a vékonybél és a vastagbél mentén. Megfigyeltük az L – sejt markerek (PYY-és GLP-1-pozitív sejtek és PYY mRNS expresszió) legnagyobb jelét a végbélben, kivéve a GCG expresszióját. A csoportok közötti megfigyelt különbségek (szignifikánsan nagyobb GCG és PYY expresszió a 2—es típusú cukorbetegségben szenvedő résztvevők vastagbélében az egészséges egyénekhez képest) következményei jelenleg nem ismertek. Jól bizonyított, hogy az inkretin hatás csökken a 2-es típusú cukorbetegségben, és felmerült, hogy a tápanyag-indukált GLP-1 szekréció hibája hozzájárulhat ennek a jelenségnek a magyarázatához. Azonban a GLP-1 tápanyag-ingerekre adott válaszait vizsgáló tanulmányok a 2-es típusú cukorbetegeknél és a nem cukorbetegeknél azt mutatták, hogy általában a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő egyének nem mutatnak csökkent plazma teljes GLP-1 választ .
eltérést figyeltünk meg a GCG expressziós szintek és a GLP-1-pozitív sejtek sűrűsége között a bél mentén. Ez azt hangsúlyozza, hogy a vékonybél egyik részében lévő L-sejtek eltérően viselkedhetnek, mint a vékonybél másik részében lévő enteroendokrin L-sejtek, amint azt Svendsen et al, aki megfigyelte, hogy az L-sejtek szekréciós mintázata patkányokban a gyomor-bél traktus mentén változik, azaz az L-sejtek eltérő arányban választják ki a PYY – t és a GLP-1-et, némelyik csak a GLP-1-et választja ki . Ezekkel a megállapításokkal összhangban valószínű, hogy a disztálisabban elhelyezkedő L-sejtek nagyobb mértékben expresszálják a proglukagont, mint a proximálisabban elhelyezkedő L-sejtek.
a vékonybél proximális részén a GIP-pozitív sejtek nagyobb GIP expressziójára és sűrűségére vonatkozó eredményeink, amelyek mind az egészséges egyéneknél, mind a 2-es típusú cukorbetegeknél disztálisan csökkennek az ileocaecalis régióban, összhangban vannak a korábbi eredményekkel . Ellentétben SJ-vel , aki úgy találta, hogy a GIP-pozitív sejtek hiányoznak a vastagbélből, képesek voltunk kimutatni a GIP-pozitív sejtek alacsony szintjét a bélrendszer disztális részében. Nem zárhatjuk ki azonban, hogy ez nem specifikus antitest-kötődés eredménye. Megfigyeltük azonban a GIP mRNS expresszióját mindkét csoport vastagbélében, bár nagyon alacsony szinten. A Gip expressziója szignifikánsan nagyobb volt a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő egyéneknél a teljes bélrendszer mentén. Feltételezhető, hogy a GIP transzkripciója A Gip rezisztencia kompenzációs eredményeként növekszik, azaz a GIP csökkent inzulinotrop hatása 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő egyéneknél megfigyelhető . Ezzel összhangban kimutatták, hogy az éhomi GIP-szint magasabb a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő résztvevőknél , mint a nem diabéteszes kontroll résztvevőknél, továbbá azt javasolták, hogy a GIP hozzájárul a 2-es típusú cukorbetegségben megfigyelt hiperglikémiához (elsősorban a GIP glukagonotrop hatása miatt) . Azonban a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő egyéneknél az orális glükóz vagy vegyes étkezést követő GIP-válaszokra vonatkozó adatok ellentmondásosak voltak, és a meta-analízissel végzett szisztematikus áttekintés azt sugallta, hogy az étkezés utáni GIP-válaszok hasonlóak a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedőknél és az egészséges egyéneknél .
tekintettel arra, hogy a savas glikoprotein CgA a sejthólyagok egyik összetevője, és több szerepet játszik az endokrin termékek szekréciós folyamatában, az enteroendokrin sejtek általános markereként használják . Ellentétben Guedes et al, aki megfigyelte a CGA-pozitív sejtek állandó sűrűségét a vékonybél mentén, tanulmányunk jelentős csökkenést mutatott. Továbbá megfigyeltük a CGA-pozitív sejtek nagyobb sűrűségét az egészséges egyének vékonybélében, mint a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedők. Feltételezhető, hogy a CgA-pozitív sejtek (enteroendokrin sejtek) teljes száma megváltozik a 2—es típusú cukorbetegségben-vagy a 2-es típusú diabéteszes állapot következtében, vagy talán hozzájárul a 2-es típusú cukorbetegség patogeneziséhez. Mindkét csoport végbélében meglehetősen nagy számú CgA-pozitív sejtet figyeltünk meg. Nemrégiben Engelstoft et al egerekben azt mutatta , hogy a CgA elsősorban a monoamint szekretáló enteroendokrin sejtekre, ritkábban pedig a peptidszekretáló enteroendokrin sejtekre lokalizálódott, talán alátámasztva az SJ javaslatát .
mivel a PC1 / 3-ról ismert, hogy a GIP, illetve a GLP-1 képződéséhez vezető prohormonokat dolgozza fel, arra számítottunk, hogy a PC1/3 jelenlétét az egész bélrendszerben megtaláljuk. A PCSK1/3 nagyobb expresszióját és a PC1/3-pozitív sejtek alacsonyabb sűrűségét figyelték meg a vékonybélben a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő résztvevők, mint az egészséges résztvevők. Amint azt fentebb vázoltuk, ezt a megállapítást úgy kell értelmezni, hogy egyes enteroendokrin sejtek bizonyos régiókban nagyon aktívak lehetnek, más régiókban pedig alacsony aktivitással rendelkeznek.
mivel a PC2 elsősorban a proglukagon glükagonná történő feldolgozásáról ismert a hasnyálmirigy alfa-sejtjeiben, érdekes volt a PCSK2 és PC2-pozitív sejtek mRNS expresszióját megtalálni a teljes bélrendszer mentén. Ez arra utalhat, hogy a glukagon a bélben termelődik ,amint azt Lund et al. Ezzel összhangban feltételezhető, hogy a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő egyének vékonybélében a PCSK2 nagyobb expressziója felesleges glukagon képződéséhez vezet, hozzájárulva a 2-es típusú diabéteszes hiperglukagonémiához. Ennek a szempontnak a további tisztázása érdekében az immunhisztokémiai kettős festést tartalmazó vizsgálatok indokoltak.
összefoglalva, az enteroendokrin k és L sejtek eloszlásának jelenlegi feltérképezése, valamint a kapcsolódó termékek expressziós szintjének megfigyelt eltérései az emberi bélrendszerben, kombinálva a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő résztvevők és az egészséges egyének közötti bizonyított különbségekkel, referenciamunkát nyújtanak a tudósok és a klinikusok számára. A keringő bélhormonokkal kapcsolatos fiziológiai vizsgálatokból származó ismeretekkel kombinálva adataink hasznosak lehetnek annak megértésében, hogy a bél hogyan járul hozzá a glükóz metabolizmusának és étvágyának szabályozásához. A PC2 azonosítása enteroendokrin sejtekben azért érdekes, mert ez összhangban lehet a glukagon képződésével az emberi bélben. Ennek a lehetőségnek a bizonyításához azonban további vizsgálatokra van szükség, és eredményeinket a 2-es típusú cukorbetegség patofiziológiájához kell kapcsolni.
