a teljes RNS-t Tripure izolációs reagenssel (Roche) extraháltuk.
az RNS-mintákat Rnázmentes DNS-sel kezeltük, és az RNeasy Mini Kit (QIAGEN) segítségével tisztítottuk. A kapott RNS riboszomális RNS-ből kimerült Ribo-Zero rRNS eltávolító készlet (humán/egér/patkány) (Epicentrum) alkalmazásával. Az rRNS-kimerült RNS-t az első szál cDNS-ének szintetizálására használtuk a felső index segítségével 6.számú első szál szintézis rendszer (Invitrogen) a gyártó utasításai szerint. Ezt követően a második szálat E. coli DNS-ligáz (Invitrogen), E. coli DNS-polimeráz (Invitrogen), és dUTP, dCTP, dATP és dGTP készlet (egyenként 10 db 6mol, Promega), a második szál pufferben (Invitrogen). Ezután a cDNS-t Covarissal nagyjából 300bp-re nyírtuk. A fragmentáció után a mintákat MinElute oszlopokkal (Qiagen) tisztítottuk. A fragmensek kiálló 3 ‘és 5′ végeit T4 DNS-polimeráz (NEB) és T4 DNS-polinukleotid-kináz (NEB) alkalmazásával javítottuk T4 DNS-ligáz pufferben (NEB). Ezután a dA végeket klenow fragmentum (3′->5’ exo-, NEB) alkalmazásával állítottuk elő a 2.pufferben (NEB). Az Adapter lekötési reakcióit ezután indexelt adapterek és gyors ligáz (Neb) segítségével állítottuk be. A termékeket az UNG (Fermentas) kezelés és a PCR amplifikáció sablonjaként használták Phusion High-Fidelity DNS polimeráz (NEB) alkalmazásával. A könyvtárakat 2%-os E-gélen jelenítettük meg, általános célú agaróz géleken (Invitrogen). A vonalkódos könyvtárakat a HiSeq2500 (Illumina) egyetlen sávján szekvenálták.
