C. fluoreszcens gyöngyökkel beágyazott poliakrilamid
az előző szakaszban leírtak szerint A Szilícium szubsztrátok értékesnek bizonyultak a gyorsan mozgó keratocyták által kifejtett erők mérésében. Ugyanezek a szubsztrátok azonban sokkal kevésbé hasznosak a legtöbb emlőssejt tanulmányozásához. A vonások pontos kiszámításához a szubsztrátot úgy kell beállítani, hogy megfeleljen az adott sejttípus mozgékonyságának és erőtermelésének. Nehéz pontosan előállítani a kívánt megfelelőségű Szilícium szubsztrátot a lassabban mozgó sejtek számára, amelyek képesek nagyobb erők kifejtésére. Ennek a korlátnak a leküzdésére Dembo és Wang (1999) szubmikrométer méretű fluoreszcens gyöngyökkel beágyazott poliakrilamid szubsztrátot használt. A poliakrilamid szubsztrátok megfelelősége kémiailag beállítható a monomer és a térhálósító koncentrációk változtatásával (Pelham and Wang, 1997). A poliakrilamid számos további előnyt kínál a szilícium szubsztrátokkal szemben. A deformációk széles skáláján lineárisan rugalmas viselkedést mutat. Ezenkívül a poliakrilamid önmagában nem alkalmas sejtkötésre, specifikus sejtadhéziós ligandumok konjugációja nélkül (Nelson et al., 2003). Ezért tökéletes állvány a sejtek tapadásának és viselkedésének szabályozható, meghatározott módon történő tanulmányozására.
az a számítási módszer, amellyel a szubsztrátumban deformációkat alkalmaznak a sejt által kifejtett húzások meghatározására, nagyon hasonló a fent említett feszített Szilícium szubsztrátokon alkalmazott módszerekhez. A fluoreszcens markerek használata azonban jelentősen javította a követési módszert és a pontos törzsmező kiszámításának képességét.
Dembo és Wang számos tanulmányt publikáltak az eredményül kapott technikával, a vonóerő mikroszkóppal, amely tisztázza a fibroblaszt migráció mechanizmusait. Pontosabban kimutatták, hogy a sejt lamellipodia szinte az összes erőt biztosítja az előre történő mozgáshoz (Munevar et al., 2001a). Eredményeik azt mutatják, hogy a lamellipodium egy mechanikus entitás, amely különbözik a sejttest többi részétől. Érdekes módon úgy tűnik, hogy a sejten belül ugyanez a mechanikai osztódás nem létezik a H-ras transzformált sejtekben, ami talán megmagyarázza mozgékony viselkedésük különbségét. Továbbá, Beningo et al. (2001) megvizsgálta a fokális adhéziók szerepét a vontatás generálásának szabályozásában, és megállapította, hogy a fokális adhéziók mérete fordítottan összefügg a generált erő mennyiségével. Ezenkívül az adhéziók eloszlása nem felel meg jól a vonóerők eloszlásának. A szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy ezek az eredmények azt jelezhetik, hogy a korai fokális komplexek felelősek az erős hajtóerőkért, és ezeknek az adhéziós helyeknek az érése passzív rögzítési helyekké változik — ezt a következtetést széles körben megvitatták az irodalomban. Ezenkívül Dembo és munkatársai megvizsgálták az elülső-hátsó adhéziók dinamikus szerepeit (Munevar et al., 2001B), miozin IIb (Lo et al., 2004), fokális adhéziós kináz (Wang et al., 2001), és a stretch-aktivált Ca2+ csatornák játszanak a fibroblaszt migrációban (Munevar et al., 2004). A vonóerő mikroszkópia segítségével Dembo és munkatársai jelentős előrelépést tettek az erőtermelés szerepének megértésében a fibroblaszt migrációban.
a poliakrilamid gél alkalmazásával az egyik legjelentősebb technikai fejlődés az a képesség, hogy megbízhatóan szabályozzuk a sejtes szubsztrát megfelelőségét az ECM sűrűségének megváltoztatása nélkül. A szubsztrát megfelelőségének hangolása kritikus fordulópont volt a vonóerő mikroszkópia fejlesztésében, mivel lehetővé tette szinte bármilyen sejttípus vizsgálatát, valamint a sejtek viselkedésének megértését a mechanikai környezet függvényében. Pelham és Wang (1997) tanulmánya előtt a legtöbb sejtmigrációt és adhéziót vizsgáló tanulmány a sejtmigrációra összpontosított az oldható kémiai környezetre (kemotaxis) vagy a szubsztrátumhoz konjugált ligandumra (haptotaxis) reagálva. Ezenkívül a sejt mechanikai környezetét érintő vizsgálatok az olyan erők hatására adott válaszra összpontosítottak, mint a folyadék nyírófeszültség és a mechanikai nyújtás. Azonban a szubsztrát merevségének megváltoztatásával Pelham és Wang (1997) jelentős változást hozott a kutatók sejtválasz és mechanotranszdukció megközelítésében. Poliakrilamid szubsztrátokat használva Pelham és Wang állandó szinten tartotta az ECM sűrűséget a szubsztrátumon, miközben megváltoztatta a mechanikai megfelelést. Kimutatták, hogy a fibroblasztok képesek aktívan reagálni szubsztrátumuk mechanikai megfelelőségére. A merevebb géleken lévő sejtek jobban elterjednek és lassabban vándorolnak, mint a megfelelőbb géleken lévő sejtek. Ezenkívül a sejtek azon képessége, hogy érzékeljék szubsztrátjuk mechanikai megfelelőségét, tükröződik abban, hogy képesek megváltoztatni a fokális adhéziós struktúrában található számos fehérje foszforilációs állapotát. A merev hordozókon a fókusz tapadások nagyobbak, hosszúkásabbak és stabilabbak, míg a megfelelőbb hordozókon a fókusz tapadások kevesebb foszforilezett pp125FAK-ot és paxillint tartalmaznak, és sokkal szabálytalanul jelennek meg. Ezek az eredmények voltak az elsők, amelyek arra utaltak, hogy a mechanikus ECM jelek ugyanolyan fontosak lehetnek, mint a kémiai jelek a sejtek adhéziójának szabályozásában.
a Pelham and Wang (1997) alapvető cikke óta számos tanulmány vizsgálta a megfelelés hatását a sejtek viselkedésére. Lo et al. (2000) használt poliakrilamid kémia létrehozni egy szubsztrátot, amely egy lépést tartalmaz merevség — a szubsztrát központi régiója, ahol két különböző megfelelőségű szubsztrát találkozik. Kimutatták a durotaxis nevű viselkedést, amellyel a sejtek képesek voltak aktívan észlelni és reagálni a szubsztrát megfelelőségének változásaira. Azok a sejtek, amelyek a lágy szubsztrátumon vándoroltak, amikor a merev–puha átmenet határát ütötték, átkeltek a merev szubsztrátumra, míg a merev szubsztrátumokon lévő sejtek nagyobb vonóerőt és nagyobb elterjedési területet mutattak, és vagy visszahúzódtak, vagy irányt változtattak a merev–puha határra reagálva. Később, Wong et al. (2003) megvizsgálta a fibroblasztok azon képességét, hogy a megfelelés gradienseit tartalmazó poliakrilamid–hidrogéleken vándoroljanak, nem pedig egy lépést, ahogyan azt Lo és munkatársai tették. Megállapították, hogy a vaszkuláris simaizomsejtek gyorsabban vándorolnak a lágyabb szubsztrátokon, mint a merevebb szubsztrátokon (15 kPa vs 25 kPa), és hogy a sejtek hajlamosak felhalmozódni a merevebb szubsztrátokon. Sőt, úgy tűnt, hogy a gradiensnek megfelelő gélek migrációs mintája a merevebb gélrégiók felé irányul, nem pedig a sejtvándorlásra jellemző tipikus véletlenszerű járási mintázatot mutatja. Engler et al. (2004) tovább vizsgálta a megfelelő gélekre adott sejtválaszt, és kimutatta, hogy a választ nagyrészt az aktin citoszkeleton összeszerelése közvetíti. A citoszkeleton változásainak tesztelésével Engler és munkatársai kimutatták, hogy az aktin enyhe túlzott expressziója a sejtben kompenzálhatja a lágy gél válaszokban tapasztalt terjedés elvesztését. Továbbá, Yeung et al. (2005) kimutatta, hogy a megfelelőségi érzékelés érzékenységi küszöbértéke sejttípus–specifikus, és hogy a sejt-sejt kapcsolatok segíthetnek a lágy szubsztrátokban tapasztalt morfológiai változások megmentésében is, hogy jobban hasonlítsanak a merevebb szubsztrátokon lévő sejtek morfológiájára (Yeung et al., 2005). Összességében a durotaxis vizsgálata még viszonylag fiatal, és még sok mindent meg kell tanulni arról, hogy a sejt mechanikusan érzékeli és reagál a szubsztrát és a környezet anyagi tulajdonságaira.
