Kluyveromyces marxianus etanol tolerancia fejlesztése az adaptív evolúció során, a több út jelentős javulásával

az etanollal szembeni rezisztencia javulása 100 napos evolúció után

a vad típusú haploid K. marxianus törzset táptalajban tenyésztettük 6% (v/v) etanollal 30 Kb C-on 100 napig körülbelül 450% etanollal tenyésztettük generációk (lásd a módszereket a részletekért). Volt egy folyamatos növekedése biomassza (mért OD600 naponta)ebben az időszakban (ábra. 1a), jelezve a sejtek túlélését etanol stressz alatt javulhat. A végén egy K. marxianus populációt kaptunk, amely jelentősen javította az etanollal szembeni rezisztenciát (ábra. 1b). A KM az evolúció előtti nyers törzsre, a KM-100D pedig a K. marxianus populációra utal a 100 napos evolúció után. A maximális etanol ellenálló képesség KM-re 7% (v/v), KM-100D-re pedig 10% volt (ábra. 1b). Összehasonlítottuk a KM és a KM-100D közötti növekedési profilokat különböző etanolszinttel rendelkező táptalajokban (0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v / v, ábra. 1c). Etanol hiányában nem volt szignifikáns különbség a törzsek között. Különbségük az etanolszint növekedésével nőtt, és a táptalajban 6% (v/v) etanollal érte el a maximumot. Ilyen körülmények között 48 óra után a km-100D biomassza majdnem kétszerese volt a KM-nek. Mindkét törzs retardált növekedést mutatott a táptalajban 7% etanollal, és nem tudott növekedni a táptalajban 8% etanollal. Ezenkívül a KM-100D figyelemre méltóan magasabb maximális növekedési sebességet mutatott, mint a KM 6% – os etanolnál (1.kiegészítő fájl: S1 ábra).

K. marxianus evolúció 6% (v/v) etanolban. a K. marxianus populáció napi OD600 értéke az evolúció során. A sejteket minden nap átvittük és szubkultúráltuk egy friss táptalajba, amely 6% (v/v) etanolt tartalmaz, ugyanazzal a kezdeti OD600 0,6 értékkel. Ezután inkubálás után 30cc-on egy orbitális rázógépben 24 órán át, OD600-at mértünk a sejtek növekedésének rögzítésére. B pöttyös hígítási analízis etanol tolerancia pre-és post-evolution. A KM és KM-100D sejteket folyékony közegben etanollal oltottuk be az egyik gradiens koncentrációban: 0, 1, 2,…, 11% (v / v), illetve 30 6 napon át inkubálva. A folyékony közegből 10 OD600 sejtszuszpenziót 5-ször sorozatosan hígítottunk, és egy YPD-lemezre foltoztunk, majd 30 6c-on 2 napon át tenyésztettük. C a KM és a KM-100D növekedési profiljai különböző etanolkoncentrációknál. A piros görbe KM-100d, a fekete pedig KM. A növekedési profil mérése során a KM-t és a KM-100D-t biológiai három példányban végezték

a DNS-elemzés azt sugallja, hogy a K. marxianusnak nincs ploidia vagy kritikus génváltozása az adaptív evolúció során

a KM-100D DNS-változásainak tisztázásához DNS-ploidia elemzést és DNS-mutáció azonosítást végeztünk. Az adaptív evolúció során a K. marxianus populáció DNS-tartalma alig változott (1.kiegészítő fájl: S2 ábra); így nem történt ploidia változás. A K. marxianus DMKU 3-1042 referencia genomjához leképezett KM És KM-100D DNS-seq analízisével megkaptuk a KM és KM-100D közötti SNP-helyeket (további Fájl 2). Az azonosított 57 SNP közül csak 4 helyszín volt domináns a KM-100D populációban. Ezek közül három a SAN1, a YAP1 és a KHT2 gének kódoló régiójában található; a másik 445 bp-nél van az ERG26 előtt. Az 1324 san1 helyét C-ről T-re mutáltuk, következésképpen a megfelelő aminosav argininből ciszteinné alakult át. A Pfam elemzése szerint azonban 32.0, ez a mutáció nem tartozik egyetlen azonosított fehérje doménbe sem. Mind a yap1, mind a KHT2 mutációk szinonim mutációk fehérje változás nélkül. A fenti eredmények azt sugallják, hogy a DNS-kontextus változásai messze nem elegendőek ahhoz, hogy támogassák a km-100D fenotípusának ilyen javulását, és a transzkripciós újraprogramozásnak hozzá kell járulnia ehhez. Ezért tovább végeztünk RNS-seq elemzést.

a 100 napos evolúció által kiváltott globális újrakábelezés

az etanol tolerancia alapos megértése érdekében RNS-seq elemzést végeztünk a KM és a KM-100D élesztők génexpresszióinak összehasonlítására, amelyek a közegben 4% és 6% (v/v) etanollal nőttek. A növekedési profilok alapján (ábra. 1C), megfigyelték, hogy a KM-100D és KM közötti növekedési képesség legnagyobb különbsége 48 óra alatt volt; ezért 48 órás mintákat gyűjtöttek az RNS-seq elemzéshez. Beállítás / log2ratio / ons 1 és p érték < 0.05 A szignifikáns Differenciálisan expresszált (de) gének meghatározásának kritériumaként hét csoportban végeztünk de gén azonosítást (ábra. 2, jelölve 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, illetve). Minden csoportban a de elemzést a kontrollra mutató nyíl szerint végeztük. A 3. Kiegészítő fájl tartalmazza az összes gén expressziós értékeit és differenciális expressziós statisztikáit. Van egy globális kifejezés különbség KM És KM-100D, ha mindkettő nőtt egy etanol-mentes közegben (ábra. 2 csoport①). A KM-100D élesztők 1342 génnel rendelkeznek, amelyek expressziója nagyobb, mint a KM élesztőé, míg csak 188 gén expressziója alacsonyabb. A 4% és 6% (v/v) etanolt tartalmazó közegekben a felfelé szabályozott gének száma KM-100d-ben jelentősen 415-re (②csoport) és 453-ra (③csoport) csökken. A felfelé szabályozott génszámok azonban még mindig sokkal nagyobbak, mint az alacsonyabb expressziójúak (104, illetve 182 gén). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a KM-100D élesztőket transzkripciósan újracsatolják nagyszámú gén aktiválásával. A javaslatot tovább támasztották alá az etanol által kiváltott expressziós változások a KM és KM-100D élesztőkön belül. 4% és 6% (v/v) etanol indukciója esetén a KM élesztők 1452 és 1465 up-szabályozott génnel rendelkeznek (csoportok). Ezenkívül hőtérképet alkalmaztunk.2 szoftver R csomagban klaszter gének és csoportok alapján log2ratio értékek (további fájl 1: ábra S3), és megállapította, hogy a gén differenciál expressziós profil csoportban ① közel van, hogy a csoport++. Összességében a KM-100D élesztők sok etanol által kiváltott expressziós tulajdonságot tartottak fenn, még akkor is, ha etanolmentes közegben növekedtek. A tulajdonságok miatt a kialakult sejt jobban alkalmazkodik a közelgő etanol stimulációhoz, azaz a KM-100D élesztőnek nem kell annyi gént aktiválnia, mint a KM.

az RNS-seq adatok globális elemzése KM-ben és KM-100D-ben etanol stressz alatt. Ezen az ábrán RNS-seq adatokat osztottunk szét a géndifferenciális expresszió elemzéséhez. A KM-t és a KM-100D-t a bal és a jobb oldali részekben mutattuk be, a 0% – os, 4% – os és 6% – os (v/v) etanolkoncentrációt pedig sorokban. Az RNS-seq-adatokat hét csoportra osztottuk, amelyeket①,②,③,④, obb, obb, stb. Minden csoportban egy nyíl mutat a differenciál expresszió azonosításának vezérlésére, a piros számjegyek pedig a felfelé szabályozott génszámot, míg a zöldek a lefelé szabályozott számot jelölik

ezt követően minden csoportban elvégeztük a de gének gén ontológiai (GO) dúsítási elemzését (további fájl 1: S4 ábra), és megállapította, hogy a dúsított GO kifejezések a sejtek alapvető fiziológiai folyamatainak széles skáláját fedik le, beleértve a riboszóma biogenezist, az aminosav bioszintézist, a DNS-javítást, az RNS-feldolgozást stb., de nem közvetlenül releváns az etanolrezisztencia szempontjából. Ezért a következőkben különösen az etanol metabolizmusával és toleranciájával erősen összefüggő útvonalakra összpontosítottunk a kapcsolódó de gének elemzésével (további Fájl 4).

KM-100D fokozott etanolhasználat

A grafikon illusztrációjának megkönnyítése érdekében az érintett de gének log2ratio értékeit (további Fájl 4) öt intervallumra osztottuk: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (fent), amint az ábrán látható. 3.

lehetséges etanolfogyasztási útvonalak K. marxianusban. Ebben az ábrán az etanolt mind a citoplazmában (a felső rész), mind a mitokondriumokban (az alsó rész) fogyasztják. A kék-szürke téglalap jelöli az érintett gént, és a csoportok①,②,③,④, Umi,, és a {\displaystyle} összhangban vannak az ábrán szereplő definíciókkal. 2. A csoportszámban a piros és a zöld a gén fel-és le-szabályozását jelöli. A szín intenzitása a génexpresszió változásának mértékét jelenti, a szín és a log2ratio érték megfelelőségét az ábra bal felső sarkában lévő színsáv számszerűsíti

a KM és a KM-100D közötti különbséget etanolfogyasztásban vizsgálták. Amint az ábrán látható. 3, két út létezhet az etanol közvetlen fogyasztására, és mindkettőt KM-ben és KM-100D-ben szabályozták, amikor etanollal szembesültek ( ④ , pcspnd, pcspnd). Az egyik módszer a citoplazmatikus ADH6, amely katalizálja az etanolt acetaldehiddé, megkönnyítve NADP+. A másik a mitokondriális ATF1, amely elősegíti az etanol észterezését acetil-CoA segítségével. Különösen, a KM-100d alatt etanol stressz (csoportok ④ és pcsp), YGL039W volt up-szabályozott, hogy több NADP+, és így a kínálat több koenzimek átalakítására etanol acetaldehid csökkentésére etanol toxicitás. A mitokondriumokban az etanol-stressznek kitett KM-ek esetében (az MND és az MND csoportoknál) csak a C2E1P301 és az ADH4 volt szabályozva. Míg a KM-100d-ben az etanolból az aldehidből az acetátba történő folyamat során a C2E1P301, az ALD4, az ADH3, az ADH4 és az ALD6 mind fel volt szabályozva (①csoport). A fent említett változások azt mutatják, hogy a KM-100D új képességet szerezhet az etanol toxicitásának enyhítésére az etanol fogyasztásának növelésével. Az elmélet elmagyarázza, hogy a KM-100D több mint KM-t végzett etanollal.

KM-100D fokozott membrán lipid bioszintézis, anti-ozmotikus nyomás, anti-oxidatív stressz, és fehérje összecsukható ellenállni etanol stressz

amellett, hogy fogyasztott, a felhalmozott etanol közvetlenül befolyásolja a sejtmembrán integritását , megváltoztatja a belső és külső – ozmotikus nyomás , megzavarja fehérje konformáció , és indukálja a reaktív oxigén fajok (ROS) generáció, ezáltal súlyos károkat okoz az élesztő sejt . A következőkben elemeztük a de géneket ezekben az útvonalakban az anti-etanol okozta károk szempontjából K. marxianusban (ábra. 4).

az anti-etanol sematikus diagramja kárt okozott K. marxianusban. Ennek az ábrának a bal oldalán a közegben felhalmozódott etanol ozmotikus nyomást gyakorol az élesztősejtre, majd aktiválja az ozmotikus reagáló utat. A középső részen a környezeti etanol behatol a sejtbe, és megzavarja a sejtmembránt. A jobb oldalon a sejtmembrán lipideket szintetizálják a sérült sejtmembrán megerősítésére és javítására. Az alsó részen az etanol megzavarja a fehérje konformációt és oxidatív stresszt okoz, így aktiválódnak a kapcsolódó érzékelők és válaszutak. A gén differenciális expressziójának csoportszámai és színei összhangban vannak az ábrán szereplőkkel. 3

az etanol által vezérelt evolúció után az alkohol stresszválasz útja KM-100d-ben aktiválódott. Az ASR1, amely etanolnak való kitettség esetén a citoplazmából a magba transzlokálódik, és az ETP1 , amely citoplazmatikus retenciós fehérjeként működik, szerepet játszik a hősokkfehérje gének etanol-függő transzkripciós aktiválásában, mind a KM-100D-ben (①csoport), mind pedig részben a KM-ben szabályozott etanolban (csoportban), ami azt sugallja, hogy még etanolmentes közegben is, a KM-100d reagáló utakat készíthet az etanol kihívására, akárcsak a KM etanolra adott válasza.

a membrán lipid képződése fontos szerepet játszik a sejtmembrán integritásának etanol stressz alatt tartásában . A telítetlen zsírsavak, amelyek a sejtmembrán szerkezetének kulcskomponensei, szorosan kapcsolódnak az etanol toleranciájához . Ábra szemlélteti. 4, az acetil-CoA-tól a telítetlen zsírsav-bioszintézisig a foszfolipidbe való beépülésig az érintett PPT2, FAD2 és TAZ1 géneket mind a KM-100D-ben szabályozták (csoport①), ami arra utal, hogy az evolúció után a KM-100D már fokozhatja a telítetlen zsírsav-bioszintézist, hogy több nyersanyagot biztosítson a sejtmembrán biogeneziséhez. És az ACC1, TSC13, FAS1 gének etanolban kitett KM-ben történő down-regulációja (a továbbiakban: MND) összhangban van az előző jelentéssel , amely magyarázhatja K. marxianus gyenge etanol toleranciáját az adaptív evolúció előtt.

számos, a sejtmembrán lipid biogeneziséhez kapcsolódó gén, köztük a foszfoglicerid, a szfingolipid és a szterin, differenciáltan expresszálódott etanol stressz alatt (ábra. 4). Különösen a foszfoglicerid bioszintézisében részt vevő géneket általában a KM-100D-ben (①csoport) és a KM-arcú etanolban (csoportban) szabályozták, jelezve, hogy a foszfoglicerid lehet az etanol-rezisztencia fő összetevője a sejtmembránban. A szterin bioszintéziséhez sok gént(pl. ERG9 és ERG7) csökkentettek a csoportban, és számos gént szabályoztak az csoportban (pl. ERG25) és a csoportban (pl. ERG26), ami arra utal, hogy a szterin biogenezis fontos lehet a magas etanolhoz való felálláshoz, de nem az alacsony etanolhoz. Ezenkívül a cki1, ERG2 és ERG25 géneket, amelyek részt vesznek a foszfogliceridben és a szterin bioszintézisében, csak az a csoportban szabályozták; ez lehet az egyik nyom a KM-100d jobb teljesítményére, mint a KM magas etanolban.

a közegben lévő magas etanol-koncentráció ozmotikus stresszt okoz az élesztősejteken . Amint az ábrán látható. 4, a plazmamembrán ozmotikus érzékelők (SLN1, OPY2 és SHO1), és a gének (HOG1, SSK1 és SSK2) részt vesz a downstream reagáló útvonal mind up-szabályozott KM kitéve alacsony etanol (csoport MND), és egyénileg up-szabályozott KM-100D (csoport①), a KM-100d szembe etanol (csoportok ① és Ann), és KM-ben szembe magas etanol (csoport MND). A glicerin előállítása a S. cerevisiae egyik fő módja az ozmotikus nyomásnak . Amikor a KM és a KM-100D etanollal került szembe, a glicerin biogenezisével kapcsolatos legtöbb gén alulszabályozott volt. A fenti megállapítások arra utalnak, hogy az evolúció előtt és után, K. a marxianus mindig javítja az ozmotikus stressz jelek érzékelésének és transzdukciójának útvonalait; azonban az ozmotikus stressz ellenállásának stratégiája nem támaszkodhat a glicerin termelési útvonalára, léteznie kell más módoknak is.

a sejtfal elegendő mechanikai szilárdságot biztosít ahhoz , hogy a sejt ellenálljon az ozmotikus nyomásnak, és a szekréciós út nemcsak a sejtfal fehérjéit szállítja kifelé, hanem a lipideket a plazmamembránra is továbbítja, hogy megerősítse a membrán szerkezetét; ezért ez a két folyamat felelős lehet az anti-ozmotikus stresszért. Elemeztük a de géneket a szekréciós útvonalban és a sejtfal biogenezisében (további fájl 1: S5 ábra). A szekréciós útvonalban és a sejtfal biogenezisében részt vevő géneket általában a KM-100d-ben (①csoport) szabályozták, és néhányat etanolban kitett KM-ben is szabályoztak (csoportban). Ez azt jelenti, hogy a KM-100D nemcsak fenntartotta az etanol stressznek ellenálló km szekréciós útvonalának szabályozását, hanem széles körben kibővítette a szekréciós út aktiválási körét az etanol támadásra való felkészülés érdekében; ezért a szekréciós útvonal javítása és a sejtfal kialakulása lehet az új stratégia, amelyet a KM-100D fejlesztett ki az etanol okozta ozmotikus stressz elviselésére. Másrészt a KM és a KM-100D alacsony etanolban való expozíciója esetén (④és obb csoportok) a szekréciós útvonal számos génjét lefelé szabályozták, ami arra utal, hogy a szekréciós útvonal aktiválása nem feltétlenül szükséges ahhoz, hogy K. marxianus reagáljon az alacsony etanolra.

az etanol által kiváltott oxidatív stressz ellen (ábra. 4), HYR1 , amely a hidroperoxid stressz érzékelőjeként és átalakítójaként működik, KM-ben és KM-100D-ben volt szabályozva, mindkettő magas etanolban (csoportban) volt kitéve. Az oxidatív stresszre reagáló transzkripciós faktorokat, az SKN7-et és az STB5-et a KM-100D-ben (①csoport) és a KM-ben magas etanollal (++csoport) szabályozták. Az anti-oxidatív stressz esetében a szuperoxid-diszmutáz rendszerben részt vevő géneket (pl. MTM1 és PRX1) általában KM-100D-ben szabályozták, vagy etanolban voltak kitéve, vagy sem ( ① , ① és obb csoportok). A tioredoxin rendszer esetében a gének (pl., MXR1 és TRR1) km-ben és KM-100D-ben szabályozták az etanolt. A tioredoxinról és reduktázáról szintén beszámoltak, hogy fokozzák a K. marxianus toleranciáját több lignocellulózból származó inhibitorral szemben . A glutaredoxin rendszer esetében a GRX2 és a GLR1 géneket csak a magas etanolban kitett KM-100D-ben szabályozták. A peroxiszóma biogenezis esetében az olyan géneket, mint a PEX6 és a PEX7, KM-100D-ben (①csoport) szabályozták, és néhány más gént (pl. PEX3 és INP2) csökkentették KM-ben és KM-100D-ben, amikor alacsony etanollal szembesültek (④és obb csoportok). A fentiek azt sugallják, hogy a KM-100D globálisan erősítheti az antioxidáns képességet.

a megfelelő fehérjehajtás biztosítása etanol stressz alatt (ábra. 4), a hsf1 hősokk transzkripciós faktort KM-ben és KM-100D-ben szabályozták alacsony etanolban (csoportok ① és obb), számos chaperonnal kapcsolatos gént (pl. PFD1 és CPR7) szabályoztak KM-ben etanolban (csoportok MND és MNF), szintén fenntartották-szabályozás KM-100d-ben (csoport①). Egyes gének (pl. CPR4) a KM-es etanolban lefelé szabályozottak nem voltak a KM-100D-ben. Ezért a KM-100D általában fokozhatja a fehérje hajtogatását, hogy stabilabb sejtkörnyezetet biztosítson.

arról számoltak be, hogy a S. cerevisiae-ben a trehalóz felhalmozódása fontos volt az etanol tolerancia szempontjából, mivel a trehalóz kompatibilis oldott anyagként működik, hogy megakadályozza a felesleges sók élesztősejtekbe történő beáramlását ; eközben a trehalóz lebomlásában részt vevő géneket etanol is indukálta, hogy az optimális koncentrációban állítsák be . K. marxianus számára (ábra. 4), Azt találtuk, hogy a trehalóz bioszintézisében és lebomlásában részt vevő gének (pl., NTH1 és TSL1) általában alacsony etanollal kezeltek (csoportok ① és obb), de a trehalóz metabolizmusában nem szabályozták a géneket, amikor magas etanolban voltak kitéve (csoportjai ojtott és ojtott). Ez arra utal, hogy K. marxianusban a trehalóz felhalmozódása speciális stratégia lehet az alacsony etanollal való megbirkózáshoz, de nem a magas etanolhoz.

A fenti etanol-toleráns útvonalakban részt vevő 15 gén differenciális expresszióját validáltuk RT-qPCR analízissel (ábra. 5). Gének kifejeződései csoportban ① (ábra. 5a) általában up-szabályozott. Másrészt, a up-szabályozás a gének csoportban ④ (ábra. 5D) és csoport (ábra. 5e) nem volt olyan magas, mint a csoportban. 5B) és csoport (ábra. 5c). Elemzésünk megerősítette, hogy az etanol toleranciához hozzájáruló gének folyamatosan aktiválódnak KM-100d-ben, még az etanol stressz visszavonása után is. A folyamatos génexpresszió hasznos lehet az intracelluláris környezet stabilizálásában és a sejtek növekedésében a közelgő stresszben.

RT-qPCR elemzés a KM és KM-100D géndifferenciális expressziójára különböző csoportokban. a KM-100D vs. KM mind az etanol-mentes közegben. Ez a de gén elemzésére szolgál a ① csoportban. b KM kitéve 4% (v/v) etanolban vs.KM etanolmentes közegben. Ez a csoport számára készült. c KM kitéve 6% (v/v) etanolban vs.km etanolmentes közegben. Ez a csoport számára készült. d KM-100D kitéve 4% (v/v) etanolban vs.KM-100D etanolmentes közegben. Ez a ④ csoport számára készült. e KM-100D kitéve 6% (v/v) etanolban vs.KM-100D etanolmentes közegben. Ez a csoport számára készült. Minden mintában a 18S-t használták belső kontrollként. A teljes RNS-t izoláltuk a 48 órán át biológiai három példányban tenyésztett sejtekből

fokozott etanolfogyasztás és többszörös stresszállóság validálása KM-100D

ellenőriztük a KM és KM-100D élesztők növekedését YNB közegben, különböző szénforrásokkal (ábra. 6a). Mind a KM, mind a KM-100D élesztők ugyanolyan képességgel rendelkeznek a glükóz felhasználására, mint az egyetlen szénforrás. 1% és 2% (v/v) etanol, mint egyedüli szénforrás jelenlétében azonban a KM-100D élesztők jobban növekedtek, mint a KM élesztők. Az eredmény alátámasztja a fent említett hipotézisünket, miszerint a KM-100D élesztők hatékonyabban használták fel az etanolt, mint a KM élesztők.

Sejtnövekedési vizsgálat etanolon és sejt életképességen és fermentáción többszörös stressz alatt. a KM és a KM-100D sejtnövekedési vizsgálata glükóz vagy etanol, mint szénforrás alapján. A 10 OD600 sejtszuszpenziót ötszörösére hígítottuk, és egyetlen szénforrásként glükózt vagy etanolt tartalmazó YNB-lemezre foltoztuk, majd 2 napig tenyésztettük, az oszlopok mentén látható módon. KM És KM-100D B-sejt életképességének vizsgálata termikus stressz alatt. A hőmérséklet 30, 37, 40 ,45, C. C. C. C. C. sejt életképességi vizsgálat oxidatív stressz alatt. A H2O2-t oxidációs stimulusként használták, koncentrációja 0%, 0,04%, 0,06% és 0,08%. a d-sejtek életképessége ozmotikus nyomás alatt. Magas só (NaCl) ozmotikus nyomást okozott, 0 m, 0,5 M, 0,6 M és 0 koncentrációval.7 M. E etanol hozam és glükóz felhasználás KM-ben és KM-100D-ben az alapvető körülmények között. f Etanolhozam és glükózfelhasználás 45% alatt, C. G Etanolhozam és glükózfelhasználás 6% (v/v) etanolterhelés alatt. h etanol hozam és glükóz felhasználás 8% (v/v) etanol stressz alatt. A B–d alszámban a KM, illetve a KM-100D az első, illetve a második sorban található. Egy 10 OD600-as sejtszuszpenziót 5-ször sorozatosan hígítottunk, és egy YPD lemezre foltoztunk, majd 2 napig tenyésztettük. Kivéve a meghatározott hőmérsékletű hővizsgálatot, más vizsgálatokat mind 30cc-n végeztünk. Az E–h alszámban a bal y tengely, a jobb y tengely a közegben lévő glükózmaradványokat (fekete színnel jelölve), illetve az etanoltermelést (kékkel jelölve) jelöli

másrészt, ábra alapján. 4, KM-100D kialakulhat ellenállás etanol okozta több feszültségek egyszerre, beleértve az ozmotikus stressz, oxidatív stressz, és a termikus stressz (a hősokk fehérjék venni chaperones fehérje összecsukható). Az élesztők többszörös feszültségre gyakorolt toleranciájának értékeléséhez a sejt életképességi vizsgálatot különböző hőmérsékletekre, oxidációra, illetve ozmotikus nyomásokra végeztük (ábra. 6b-d). Az alapfeltételben (azaz 30 db C, 0% H2O2 és 0 M NaCl) hiányzik a KM és a KM-100D élesztők életképessége közötti különbség. A különböző feszültségek jelenlétében azonban a KM-100D élesztők lényegesen jobb életképességet mutatnak, mint a KM élesztők. Továbbá az előnyök jelentősebbek, míg a feszültségek súlyosabbá váltak (ábra. 6b-d). Arra számítottunk, hogy a többszörös feszültségek tűrései új tulajdonságokat vezethetnek be az élesztők számára az etanolgyártásban.

tovább vizsgáltuk az etanol termelékenységét a KM és a KM-100D élesztők között több feszültség alatt. Alapvető körülmények között (30 Kb C és 0% etanol, ábra. 6e), a KM és a KM-100D élesztők közel azonosak mind a glükózfogyasztásban, mind az etanolgyártásban. A KM-100D élesztők azonban jelentős előnyöket mutattak magas hőmérséklet jelenlétében (45 Kb, ábra. 6f) vagy több etanol(6% vagy 8%, ábra. 6g, h); a közös környezet általában az erjedés késői szakaszában történt. RT-qPCR elemzést végeztünk mind a KM, mind a KM-100D élesztők esetében, amelyeket 6% – os etanollal fermentáltunk 48 órán, 72 órán és 120 órán keresztül (ábra. 7). Ezen etanol-toleráns gének többségét KM-ben-100D-ben-szabályozták a KM-hez képest, különösen a korábbi szakaszban (48 h) az etanol kezdeti beállításához (ábra. 7). Összefoglalva: az etanol-toleráns gének expressziójának szabályozásával a KM-100D élesztők stresszes környezetben, megnövekedett etanol hozammal felülmúlják a KM élesztőket.

RT-qPCR elemzés GÉNEXPRESSZIÓKRA km-ben és KM-100D-ben az erjedés során. a KM-100D vs. KM mind a 48 h erjedés. b KM-100D vs. KM mind a 72 h erjedés. c KM-100D vs. KM mind a 120 h erjedés. Minden mintában a 18S-t használták belső kontrollként. Mind a KM – t, mind a KM-100D-t 6% etanollal tenyésztették. A teljes RNS-t biológiai három példányban tenyésztett sejtekből izoláltuk