1. KRAS 2. exon (12/13.kodon) és 3. exon (61. kodon) mutációs vizsgálat: cobas (cobas) kras mutációs teszt in Vitro diagnosztikai célra (Roche).
a cobas-féle kras mutációs teszt egy valós idejű PCR-teszt a KRAS gén 2.exonjában (12/13. kodon) és 3. exonjában (61. kodon) lévő szomatikus mutációk kvalitatív kimutatására 100 ng DNS-bemenet segítségével. A teszt 19 KRAS mutációt képes kimutatni. A mutációk jelenlétét legalább 99%-os analitikai specifitással és legalább 5% – os mutáns szint kimutatási határral detektálják a vad típusú genomi DNS hátterében.
a cobas-féle kras mutációs teszt két fő folyamaton alapul: (1) kézi mintaelőkészítés a legalább 10% tumorsejtet tartalmazó FFPE CRC szövet Egy vagy két, 5 MHz vastag szakaszából származó genomi DNS kinyerésére; (2) a cél DNS PCR-amplifikációja komplementer primer párokkal és két fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid próbával. Az alkalmazott primer párok egy 85 bázispár szekvenciát határoznak meg a 2.exon esetében, amely a 12. és 13. Kras kodont tartalmazza, és egy 75 bázispár szekvenciát a 3. exon esetében, amely a 61. Kras kodont tartalmazza a humán genomi DNS-ben. Az egyik szondát a KRAS kodon 12/13 szekvencia kimutatására tervezték a 2. exonban, a másik szondát pedig a KRAS kodon 61 szekvencia kimutatására tervezték a KRAS gén 3.exonjában. A mutáció kimutatása a Cobas z 480 analizátor (1) olvadásgörbe elemzésével érhető el.
2. KRAS mutációs teszt v2 (LSR)
a KRAS mutációs teszt v2 (LSR) egy allél-specifikus, valós idejű PCR-teszt a V-ki-ras2 Kirsten patkány szarkóma vírus onkogén homológ (KRAS) génjének 2., 3. és 4. exon mutációinak kvalitatív kimutatására és azonosítására formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott szövetből (ffpet). A teszt célja 28 egyedi mutáció kimutatása. A mutációk jelenlétét legalább 99%-os analitikai specifitással és legalább 1% – os mutáns szint kimutatási határral detektálják a vad típusú genomi DNS hátterében.
a KRAS V2 mutációs teszt (LSR) két eljáráson alapul: (1) kézi mintaelőkészítés genomi DNS kinyerésére az FFPET-ből; és (2) PCR-amplifikáció és a cél DNS kimutatása komplementer primer Párok és fluoreszcens festékekkel jelölt oligonukleotid próbák segítségével.
a KRAS mutációs teszt v2 (LSR) olyan primereket használ, amelyek specifikus bázispár szekvenciákat határoznak meg az egyes célzott mutációkhoz. Az amplifikáció csak a KRAS gén régióiban fordul elő a primerek között; az egész gén nem amplifikálódik. A célzott KRAS szekvenciák 79-114 bázispár között mozognak. A mutáció kimutatása PCR analízissel történik a Cobas z 480 analizátorral. (1)
3. BRAF/NRAS mutációs teszt (LSR)
a BRAF / NRAS mutációs teszt (LSR) egy allél-specifikus, valós idejű PCR-teszt a proto-onkogén B-Raf (BRAF) gén 11.és 15. exon mutációjának, valamint a neuroblastoma Ras virális onkogén homológ (NRAS) gén 2., 3. és 4. exon mutációjának kvalitatív kimutatására és azonosítására formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott szövetből (ffpet).
a tesztet 36 egyedi mutáció kimutatására tervezték. A mutációk jelenlétét legalább 99%-os analitikai specifitással és legalább 5% – os mutáns szint kimutatási határral detektálják a vad típusú genomi DNS hátterében.
a BRAF/NRAS mutációs teszt (LSR) két fő folyamaton alapul: (1) kézi mintaelőkészítés genomi DNS kinyerésére az FFPET-ből; és (2) PCR-amplifikáció és a cél DNS kimutatása komplementer primer Párok és fluoreszcens festékekkel jelölt oligonukleotid próbák segítségével.
a BRAF/NRAS mutációs teszt (LSR) olyan primereket használ, amelyek specifikus bázispár szekvenciákat határoznak meg az egyes célzott mutációkhoz. Az amplifikáció csak a BRAF vagy az NRAS gének régióiban fordul elő a primerek között; az egész gén nem amplifikálódik. A BRAF szekvenciák 101-120 bázispár között mozognak. Az NRAS szekvenciák 94-121 bázispár között mozognak. A mutáció kimutatása PCR analízissel történik a Cobas z 480 analizátorral. (2)
klinikai következmények
a KRAS és az NRAS közeli rokonságban álló Ras onkogén családtagok, és a 12-es, 13-as (2.exon), 61-es kodon (3. exon) és 146-os kodon (4. exon) bármelyik génjének mutációi a guanozin-trifoszfáthoz kötött Ras fehérjék szintjének emelkedését eredményezik. A hiperaktív Ras jelátvitel elősegíti az onkogenezist. A colorectalis carcinoma (CRC) esetében a KRAS és NRAS mutációk ezeken a kodonokon az esetek legfeljebb 50%-ában találhatók meg, és az anti-EGFR terápiára adott válasz hiányát jelzik előre. A legtöbb RAS mutáció a KRAS 2. exonban előforduló pontmutációk (12 vagy 13 kodonok; körülbelül 40%). Az egyéb RAS mutációk ritkábban fordulnak elő, a leggyakoribb mutációk a KRAS 3.és 4. exonjaiban, valamint az NRAS 2. és 3. exonjaiban fordulnak elő (3).
a melanómák körülbelül 50% – a hordozza a BRAF aktiváló mutációit. A BRAF mutációk több mint 90%-a 1799 t nukleotid>változást eredményez, amely valin-glutaminsav szubsztitúcióhoz vezet a 600-as pozícióban (V600E). A BRAF V600E mutáció a MAPK útvonal ellenőrizetlen jelzését okozza, ami túlzott sejtnövekedéshez és proliferációhoz vezet. Az aktivált mutáns BRAF-ot célzó szerek (BRAF-inhibitorok) sikeresnek bizonyultak metasztatikus melanomában szenvedő betegeknél, amelyek ezt a mutációt hordozzák (1-3).
a melanoma prediktív értékén kívül a BRAF V600E mutációnak prognosztikai értéke is van a vastagbélrákban és a tüdőrákban (NSCLC) (4,5,7). A BRAF V600E mutáció a metasztatikus colorectalis carcinoma körülbelül 10% – ában található meg, és mikroszatellit instabilitás jelenlétével társult (6). Összességében a BRAF mutáns CRC-ben szenvedő betegeknél alacsony a válaszarány a hagyományos terápiákra és a kedvezőtlen prognózis. Míg a BRAF V600-mutált melanómák érzékenyek a BRAF-inhibitorokra, a BRAF V600-mutált CRC-k nem biztos, hogy olyan érzékenyek. Az EGFR aktiválása vastagbélrákban megmagyarázhatja, hogy a vastagbélrák miért általában alacsonyabb választ ad a BRAF-gátlókra. Ezért javasolt EGFR – és BRAF-gátlókkal kombinált kezelést kezdeni.
a BRAF V600E mutáció az összes tüdőrák 3-5% – ában is megtalálható (7). Míg a BRAF-inhibitorok sikeresnek bizonyultak V600E mutáció-pozitív nem kissejtes tüdőkarcinómában szenvedő betegeknél, az FDA jóváhagyta a BRAF – és MEK-inhibitor kombinációs terápia alkalmazását V600E mutációval rendelkező nem kissejtes tüdőkarcinómában szenvedő betegeknél egy nemzetközi, multicentrikus, három kohorsz, nem randomizált, nem összehasonlító, nyílt elrendezésű vizsgálat eredményei alapján lokálisan megerősített BRAF V600E mutáció-pozitív metasztatikus nem kissejtes tüdőkarcinómában szenvedő betegeknél.
Minta követelmények
a vizsgálathoz elfogadható minták a formalinnal rögzített, paraffinnal beágyazott colorectalis carcinoma szövetminták, amelyek rögzítési ideje 6-48 óra.
térfogat
1 reprezentatív paraffinblokk előnyös. Alternatív megoldásként a reszekciós mintákhoz legalább 5 festetlen szövetszakaszra van szükség (5 MHz vastag) (teljes RAS vizsgálat).
tárolási és szállítási utasítások
a példányok karbantartása és szállítása környezeti hőmérsékleten.
korlátozások
az elégtelen tumortartalom nem teszi lehetővé a KRAS/NRAS/BRAF mutációk kimutatását: a tumorsejtek 10% – ára van szükség. A tumortartalmat az elemzés előtt értékelik, majd makrodissekciót végeznek. A formalintól eltérő fixálószerek vagy a hosszabb fixációs idő nem megfelelő eredményeket eredményezhet.
különleges követelmények
nincs.
fordulási idő
5-7 munkanap a csúszdák és a paraffinblokkok esetében.
- Li et al. Erősen ellenőrzött vizsgálat a KRAS mutáció kimutatására tüdő -, colorectalis és pancreas rák szövetében és plazmájában. Arch Pathol Lab Med. 2019 febr;143:183-9
- Patten et al. Érzékeny és pontos teszt 36 BRAF és NRAS mutáció egyidejű kimutatására. Journal of Clinical Oncology 2018 36:15
- Douillard JY et al. Panitumumab-FOLFOX4 kezelés és Ras mutációk colorectalis rákban. N Engl J Med. 2013 szeptember 12; 369(11): 1023-34.
Frissítve 03 December 2019
