nagy hűségű & hatékony PCR enzim: KOD DNS polimeráz
a hipertermofil archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (korábban Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (ábra. 1) izoláltuk egy szolfatarikus forró forrás (ábra. 2) A Kodakara-szigeten (ábra. 3) Japánban, és azonosították és jellemezték.
a család B DNS polimerázt (KOD DNS polimeráz) találtak ebben a KOD1 törzsben, és különböző egyedi tulajdonságokat mutat (1).
-
Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
Fig. 2. Solfatara (Kodakara-sziget, Japán)
-
Fig. 3. Kodakara-sziget (Kagoshima prefektúra, Japán)
a KOD DNS-polimeráz erős 3’6′ – os exonukleáz aktivitást mutat (lektorált aktivitás), amely aktivitás a Taq DNS-polimerázból hiányzik.
Ezen túlmenően ez az enzim kiváló folyamat-és megnyúlási képességet mutat, ötször nagyobb kiterjesztési sebességet (100-130 nukleotid/másodperc) és 10-15-szer nagyobb folyamatosságot (>300 bázis) mutat, mint a Pyrococcus furiosus (Pfu DNS-polimeráz). Ennek az enzimnek a megnyúlási sebessége körülbelül 2-szer nagyobb, mint a Taq DNS-polimerázé (1.táblázat)(ábra. 4) (1).
1.táblázat. A termostabil DNS-polimerázok tulajdonságai
| Proterty | a jelzett DNS-polimeráz értéke | ||
|---|---|---|---|
| KOD DNS-polimeráz | Pfu DNS-polimeráz | Taq DNS-polimeráz | |
| eredet | Archaea | Archaea | baktériumok |
| levezetett molekulatömeg (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| optimális hőmérséklet (CA)) | 75 | 75 | 75 |
| optimális pH 75 CA-nál | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| Termosztabilitás (felezési idő) | 95 65 6830>12 óra; 100 oc,3,0 óra | 95 6 óra; 100 + 2,9 óra | 95 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. A Kod PFU és a Taq DNS polimeráz megnyúlási sebességének összehasonlítása.
a megnyúlási sebességet a szintetizált DNS hosszának megfelelően mértük, az M13 ssdns-t mint sablont használva 75 CA-nál.
a Kod DNS-polimeráz aktivitásának vizsgálatával párhuzamosan a polimeráz és a Korrektúra aktivitásának semlegesítő antitestjeit fejlesztették ki (2). Ezek az antitestek alkalmazhatók a” hot start PCR technológiára ” KOD DNS-polimeráz alkalmazásával.
a DNS-polimeráz 3-D szerkezetét 2003-ban jellemeztük (ábra. 5) (3).
Fig. 5. A Kod DNS polimeráz 3-D szerkezete
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus – (kódszám. KOD-201) KOD DNS polimeráz alapján fejlesztették ki, és magas PCR-hűséget mutat (2.táblázat).
2.táblázat. Az egyes PCR-enzimek mutációs gyakoriságának összehasonlítása.
| összes szekvenált bázis | mutált bázisok száma | mutációs gyakoriság (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD-Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu DNS polimeráz | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Taq – bázis hosszú PCR enzim | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq DNS polimeráz | 102,708 | 145 | 141.2 |
a hűséget mutációs gyakoriságként mértük a PCR termék szekvenálásával. A PCR termék klónozása után (2,4 kb humán béta-globin régió) körülbelül 96 klónt választottunk ki és szekvenáltunk.
KOD FX (kódszám. A KFX-101-et kod DNS polimeráz alapján fejlesztették ki, és sokkal nagyobb PCR-sikerarányt mutat (a hatékonyság és a megnyúlási képességek alapján), mint a KOD-Plus- (kódszám). KOD-201) vagy más Taq-alapú PCR enzimek. A Kod FX a nyers minták (pl. egér farok lizátum, tenyésztett sejtek) amplifikálására is hatékony.
Fig. 6. Közvetlen amplifikáció nyers egér farok lizátumból
1,2: KOD FX
3~6: más vállalat enzimjei
M: markerek
