A KDM6A, az MLL2-vel kölcsönhatásba lépő hiszton-Demetiláz delécióját három,Kabuki-szindrómában szenvedő betegnél | Jumbuck

főszöveg

Kabuki-szindrómában (KS; Mim 147920) először 1981-ben írta le Niikawa és Kuroki,1, 2 és több mint 400 esetet jelentettek a szakirodalomban. A fő klinikai jellemzők a megkülönböztető arcvonások, a fejlődési késleltetés, az enyhe vagy közepes értelmi fogyatékosság, a szülés utáni növekedési retardáció és további jellemzők, beleértve a csontváz anomáliákat, a hypodontia és a tartós magzati ujjbegypárnákat. Az összehasonlító genomi hibridizáció (CGH) mikroarray analízis nem tudta kimutatni a visszatérő anomáliát 72 KS egyénben.3-8 az exome-szekvenálási stratégia alkalmazása a közelmúltban az MLL2 (MIM 602113) mutációk azonosításához vezetett, mint a KS fő oka.9 öt nemrégiben megjelent sorozatban az MLL2 mutációit a KS betegek 56-76% – ában találták meg.9-13

mivel a betegek jelentős hányada nem rendelkezik kimutatható MLL2 mutációval, feltételeztük a KS-hez kapcsolódó további gének létezését. Egy másik KS-t okozó genetikai mutáció keresése során tíz MLL2-vel kölcsönhatásban lévő gént szűrtek 15 MLL2-mutáció-negatív KS egyénben, és nem azonosítottak patogén mutációkat.11 egy másik, MLL2-kölcsönhatásban lévő fehérjét kódoló gént, a KDM6A-t (korábban UTX; MIM 300128 néven ismert) 22 MLL2-mutáció-negatív KS egyénben szűrtük, és ismét nem találtunk okozati mutációt.13

array CGH analízissel (Agilent platform 244k) de novo Xp11.3 mikrodeléciókat azonosítottunk két belga MLL2-mutáció-negatív KS lánynál (1.és 2. beteg). Mivel mindkét törlés de novo volt, valószínűleg patogén. Mindkét Törlés a KDM6A egy részét vagy egészét tartalmazta. ezenkívül egy korábbi vizsgálatban nem voltak KDM6A törlések 411 normál kontrollból álló kohorszban.14 az 1. betegben a deléció a KDM6A 21-29 exont tartalmazta, amely a KDM6A katalitikus doménjének terminális részét kódolja, valamint a cxorf36 gént, amely nemrégiben szerepet játszott az X-kapcsolt autizmusban.15 a 2. betegben a KDM6A, CXorf36, DUSP21 (MIM 300678) és a FUNDC1 (1.ábra) teljesen eltávolításra került. A DUSP21 és a FUNDC1 funkciói ismeretlenek.

az Xp11.3 régió a betegek

törlését mutatja az Xp11.3 régió az UCSC Genom böngészőből (GRCh37/hg19) vett törléseket mutatja az 1., 2. és 3. betegek esetében. A fekete teljes sávok az egyes betegek törlését jelzik, és minden beteg száma a saját sávja felett van. A deléció az 1. betegben 283,5 kb-ot ölel fel a 44 941 324 bázistól a 45 224 829 bázisig, a 2.beteg deléciója 815 bázisig terjed.7 kb a 44 377 858 bázistól a 45 193 629 bázisig, a 3.beteg deléciója pedig 45,4 kb-ot ölel fel a 44 866 302 bázistól a 44 912 718 bázisig. A területen lévő géneket a deléciós sávok alatt jegyezzük fel. A genomi variánsok adatbázisában szereplő CNV-k az alsó sorokban láthatók. Nincsenek korábbi jelentések KDM6A példányszám változások.

ezután szekvenáltuk a KDM6A-t Sanger szekvenálással, és intragén deléciókat vagy duplikációkat kerestünk egy célzott egyéni Agilent tömb CGH-val 22 MLL2-mutáció-negatív KS egyénből álló kohorszban (8 nőstény, 14 hím). Az Institut de Pathologie et de G adapt Etikai Bizottságának etikai normáival összhangban szülői beleegyezést kaptak a tanulmány összes résztvevőjének DNS-elemzéséhez és fényképek közzétételéhez. A CGH microarray adatok (kiegészítő adatok, online elérhető) ebben a kiadványban már letétbe a National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO)16 és elérhető csatlakozás gse32567 (lásd csatlakozási számok szakasz).

pontmutációkat nem észleltek, de azonosítottunk egy de novo intragén deléciót (5-9 exonok) egy olasz, férfi KS egyénben (3.beteg). Szekvenáltuk az UTY-t (mim 400009), a KDM6A Y kromoszóma paralogját (lásd alább), és intragén deléciókat vagy duplikációkat kerestünk a fentiek szerint, de nem találtunk mutációt.

az 1-es és 3-as betegek tipikus KS fenotípussal rendelkeztek, beleértve a hosszú palpebralis repedéseket, az alsó szemhéj laterális elfordulását és a közepesen súlyos vagy súlyos értelmi fogyatékosságot (1.táblázat és 2. ábra). Bár a 2. beteg arcvonásai nem voltak olyan klasszikusak, ennek a rendellenességnek számos jellemzőjét mutatta, beleértve a szemöldök laterális ritkaságát, a hosszú szempillákat, a strabismust, a hosszú palpebrális repedéseket, a nagy és kiemelkedő füleket, a tartós magzati ujjbegypárnákat, aorta coarctatiót, az areoláris teljességet csecsemőkorban és hirsutizmust. Enyhe fejlődési késleltetést mutatott, normál verbális intelligencia hányados (IQ) pontszámmal, gyenge teljesítmény IQ pontszámmal és hiperaktív viselkedéssel (1.táblázat és 2. ábra). Megállapítottuk, hogy az 1-es és 2-es betegek hosszú hallucinációkkal rendelkeztek (3.ábra).

arc megjelenése az érintett egyéneknél

a) beteg 1.

B) 2.Beteg.

C) 3.Beteg.

vegye figyelembe az 1.és 2. betegek hosszú palpebralis repedéseit, valamint az 1. (enyhe) és 3. betegek ívelt szemöldökét.

a lábak megjelenése az érintett egyéneknél

(a) beteg 1.

B) 2.Beteg.

vegye figyelembe a hosszú hallucinációkat mindkét betegnél.

így a KDM6A deléciók ebben a három betegben széles fenotípusos spektrummal társulnak, a tipikus KS egyénektől (1.és 3. betegek) az enyhébb klinikai megjelenésig (2. beteg). Ez a klinikai variabilitás az MLL2 mutációkban szenvedő betegek jellemzője is.13 ugyanakkor figyelembe kell venni a cxorf36 deléciónak az 1.betegben, valamint a CXorf36, DUSP21 és FUNDC1 deléciónak a 2. betegben a megfelelő fenotípusra gyakorolt lehetséges hatásait is.

KDM6A (29 exon) az egyik X kromoszómális gén, amely nagyrészt elkerüli az X inaktivációt.17 egy 1401 maradék fehérjét kódol, amely két funkcionális domént tartalmaz. A katalitikus domén egy hiszton-demetiláz, amely specifikusan katalizálja a mono-, di-és trimetilezett lizin 27 demetilezését a hisztonon H3 (H3K27).18,19 ez a demetiláció közvetíti a különböző gének szövetspecifikus expresszióját, és leginkább a fejlődési folyamatokban és a sejtciklusban vesz részt.19-22 érdekes módon a KDM6A és az MLL2 együtt hatnak a transzkripcionálisan aktív kromatin epigenetikus szabályozásában a Polikombcsoport (PcG) fehérjék ellensúlyozásával.22 A KDM6A másik funkcionális doménje szerepet játszik a kromatin átalakításában azáltal, hogy kölcsönhatásba lép a kapcsoló/szacharóz nem erjedhető (SWI/SNF) átalakító komplexummal, amely a brg1.23

transzkripciós aktivátort tartalmazza, mint az MLL2, a KDM6A is szerepet játszik az embriogenezisben és a fejlődésben. Homozigóta dUTX (Drosophila KDM6A ortholog) a Drosophila mutánsok durva szemeket, diszmorf szárnyakat és a nemi Fésűk módosítását mutatják.21 Ez a fenotípus hasonlít a trithorax fenotípusra, tovább alátámasztva azt az elképzelést, hogy a KDM6A ellensúlyozza a PcG elnyomását.21 továbbá, UTX-1 (C. elegans KDM6A ortholog) befolyásolhatja a C. elegans vulval prekurzor sejtek fejlődési sorsának döntéseit a retinoblastoma (RB) fehérje komplexet kódoló gének transzkripciós szabályozásával, amelyet a férgektől az emberig konzerváltak.20 a Kdm6a1 szintén fontos a zebrafish hátsó HOX génjeinek expressziójában.19 ezenkívül a KDM6A az MLL2-vel együtt nagy szerepet játszik az izomspecifikus gének szabályozásában az embriogenezis során.22,24 végül egy másik fontos fejlődési géncsalád tagjai (T-box gének, amelyek a mezodermában hatnak a szív és a csigolyák kialakulásában) toborozzák a KDM6A-t, hogy aktiválják célgénjeiket, ismét hangsúlyozva a KDM6A szerepét a fejlődési folyamatokban.23 érdekes módon az emberi betegségekben jelentett T-box gének patogén mutációinak többsége a KDM6A-val kölcsönhatásba lépő T-box doménben található.23

a KDM6A elkerüli az X inaktivációt, 17 de felvetődött, hogy egerekben az inaktív X kromoszómából származó Kdm6a expresszió lényegesen alacsonyabb, mint az aktív X kromoszómából.25 a Kdm6a expresszió magasabb a felnőtt agyban, a felnőtt májban és a specifikus fejlődő agyi régiókban a nőknél, mint a férfiaknál.25 UTY a KDM6A paralógja az Y kromoszómán.17 az UTY aminosav-szekvenciája 84% – os hasonlóságot mutat a KDM6A-val, és kompenzálhatja a KDM6A fokozott expresszióját a nőknél, annak ellenére, hogy a DEMETILÁZ aktivitást még nem bizonyították erre a KDM6A paralógra.14,25

nem meglepő, hogy az X kromoszómán egy másik, a KS-hez kapcsolódó gént találunk, mivel KS-szerű betegekről számoltak be, akiknek kis gyűrűs x (r) kromoszómája van.26-34 ezenkívül egyértelmű átfedés van a férfi KS-betegeknél (aorta coarctatio és más bal oldali obstrukciók) és a monoszómiás X és r(X) kromoszómában szenvedő betegeknél előforduló veleszületett szívhibák között.28,35 kicsi r(X) kromoszóma általában Turner-szindrómához vezet az r(X) teljes inaktiválása révén. Nem világos azonban, hogy egyes egyéneknél miért alakul ki KS-szerű fenotípus. Egyes R(X) betegeknél a KS fenotípus magyarázataként javasolták az X kromoszóma hiányos inaktiválását és az azt követő, általában elnyomott gének expresszióját.A 32-34 KDM6A-t törölték abban a három betegnél, akiknek mind KS-szerű fenotípusa, mind r(X) volt, amelyben a töréspontokat leképezték; ez a megállapítás összhangban van azzal a hipotézissel, hogy a KDM6A deléció fontos szerepet játszik az egyes R(X)-es betegeknél megfigyelt KS-szerű fenotípusban.30,32,34 nem tudtuk bizonyítani a KDM6A haploinsufficienciáját az 1-es és 2-es betegeknél, mivel a KDM6A expressziója nagyon alacsony volt a perifériás vér limfocitáiban (az adatok nem szerepelnek). Mindazonáltal a vizsgálatok kimutatták, hogy a Kdm6a két példánya szükséges a normál expresszióhoz nőstény egér embriókban és felnőtt egerekben,25 ami arra utal, hogy a haploinsufficiency lehet a patogén mechanizmus. Ez a magyarázat azonban nem magyarázza azt a tényt,hogy a KDM6A delécióval rendelkező 45, X és más R(X) betegeknél nem mindegyiknél alakul ki a Kabuki fenotípus.

az 1-es és a 2-es betegeknél a molekuláris X inaktivációs Arány erősen torz, sorrendben 89:11 és 97:3. Az X inaktivációs profilt az androgénreceptor gén 1. exonjában a Cag-ismétlés PCR-amplifikációjával határoztuk meg a DNS-emésztés előtt és után HpaII-val és CfoI-val. Annak meghatározására, hogy a KDM6A törölt példánya az aktív vagy inaktív X kromoszómán található-e, fluoreszcencia in situ hibridizációs (FISH) elemzést végeztünk egy KDM6A szondával az X kromoszómákon, amelyeket differenciálisan jelöltünk az 5-bróm-2′-dezoxiuridin (5-BrdU) beépítésével. Az eredmények azt mutatták, hogy a KDM6A törölt példánya az inaktív X kromoszómán található mind a 70 mitózisban, amelyet mindkét betegnél elemeztek (4.ábra). Az a tény, hogy a KDM6A megszökik az X-inaktiválástól17 arra utal, hogy a fitohemagglutinin (PHA)-stimulált limfociták, amelyeknek az inaktív X kromoszómán a KDM6A törölt példánya van, túlélési előnnyel rendelkeznek azokkal a sejtvonalakkal szemben, amelyeknek az aktív X kromoszómán a KDM6A törölt példánya van. Ez a javaslat összhangban van azzal a hipotézissel, hogy bár a KDM6A elkerüli az X inaktivációt, expressziója alacsonyabb az inaktív X kromoszómából, mint az aktív X kromoszómából.25

az X kromoszómán végzett HALVIZSGÁLAT képe Differenciálisan 5-BrdU-val jelölt

a HALVIZSGÁLAT képe az X kromoszómákat differenciálisan jelöli az 5-BrdU beépítésével. Az inaktív X kromoszóma (a fehér körben) világosabbnak tűnik, mint az aktív X kromoszóma. Az Xqter szubtelomer próbák mindkét X kromoszómához hibridizálódnak (kék nyilak). A KDM6A jel (fehér nyíl) hiányzik az inaktív X kromoszómából, és jelen van az aktív X kromoszómán. Ehhez a kísérlethez az 1-es és 2-es betegek perifériás vér limfocitáit fitohemagglutininnel stimuláltuk, és 72 órán át tenyésztettük. a későn replikáló inaktív X kromoszóma azonosítása érdekében a sejteket 5-BrdU-Val (30 6G/ml) 5 órával kezeltük a betakarítás előtt. A Colcemid-et ezután 0,2/ml koncentrációhoz adtuk, majd 1 órával később metafázisos készítményeket állítottunk elő standard eljárásokkal, amelyek 75 mM-es KCL-ben duzzadtak és 3:1-es metanolban/ecetsavban rögzítettek. FISH analízist végeztünk egy subtelomer xqter szondával, melyet SpectrumOrange-val (vysis) jelöltünk az X kromoszómák (kék nyíl) és az Rp11-435k1 spectrumorange-val (AmpliTech), hogy megkülönböztessük a törölt és nem törölt x kromoszómákat (fehér nyíl). A beépített 5-BrdU kimutatásának megkönnyítése érdekében denaturáltuk a sejtes DNS-t 2N HCl-ben 30 percig 37 6CL-en C. 5-A BrdU-t ezután 5-BrdU-specifikus monoklonális antitesttel jelöltük fluoreszceinhez (Roche) konjugálva (1 ~ g/ml). Végül, ellensúlyoztuk a DNS-t 0-t tartalmazó antifade oldat alkalmazásával.1 db dapi.

az UTY szerepe nagyrészt ismeretlen, és nincs in vitro demetiláz aktivitása. A KDM6A intragén deléciójával rendelkező és az 1.betegéhez hasonló klinikai súlyosságú férfi KS-egyén (3. beteg) megállapítása arra utal, hogy az UTY részben kompenzálhatja a KDM6A elvesztését férfi egyénekben, amint azt a szakirodalom korábban javasolta.25

ami az MLL2-t illeti, a KDM6A szomatikus homozigóta és hemizigóta mutációit különböző ráktípusokban (myeloma multiplex, nyelőcső laphámsejtes karcinóma, vesesejtes karcinóma, mieloid leukémia, emlőrák, colorectalis rák és glioblastoma) azonosították, ami arra utal, hogy a KDM6A tumor-elnyomó gén.14 Mindazonáltal a rák nem a KS egyik fő jellemzője, mivel ezt a szövődményt csak hét KS betegben jelentették 36, 37 (akut limfoblasztos leukémiát, Burkitt limfómát, fibromyxoid szarkómát, szinoviális szarkómát és hepatoblastomát egyszer jelentettek, neuroblasztómát pedig két KS egyénnél jelentettek).35,36 ha mindkét allél elvesztése elegendő ahhoz, hogy rákot okozzon, akkor arra lehet számítani, hogy a rák gyakrabban fordul elő KS-ben, például retinoblasztómában (mim 180200) vagy Wilms-daganatban (Mim 194070). Ez vagy arra utal, hogy a második allél elvesztése az MLL2-ben, a KDM6A-ban vagy az UTY-ban szükséges, de nem elegendő a rák kialakulásához, vagy hogy ezt a szövődményt alábecsülik, bemutatva a Természettudományi vizsgálatok fontosságát ritka szindrómákban.37

a következő hiszton-metilázok és hiszton-demetilázok érintettek más többszörös anomáliás szindrómákban: EHMT1 (mim 607001; Kleefstra szindróma ), SETBP1 (Mim 611060; Schinzel-Giedion szindróma ), JARID1C (mim 314690; Claes-Jensen-típusú, X-kapcsolt mentális retardációs szindróma ), PHF8 (mim 300560; Siderius-típusú, X-kapcsolt mentális retardációs szindróma) és MLL2 KS – ben. A KDM6A patogén mutációk azonosítása KS-ben szenvedő betegeknél kiterjeszti a hiszton-módosító faktorok szerepét az értelmi fogyatékosságban és a veleszületett malformációban.

összefoglalva, a KDM6A mutációkat a KS okaként jelentjük egy hím és két nőstény esetében. Eredményeink megerősítik mind a KS genetikai heterogenitását, mind az X kromoszóma lokuszát, amint azt korábban javasolták. Mivel néhány KS-beteg negatív volt az MLL2, KDM6A és UTY szekvenálás szempontjából, és a szűrés során nem mutattak deléciót vagy duplikációt, valószínű, hogy más KS-hez kapcsolódó gének felfedezésre várnak.