kináz Assay
Swathi Arur készítette
Protein kináz (1-10 mg/ml tiszta kináz törzsoldatok) – ezekhez a vizsgálatokhoz tisztított ERK2 kinázt (NEB) használok. Minden enzim esetében fontos meghatározni az optimális puffert, az ionerősséget és a pH-t az aktivitáshoz. Ha ezeket a feltételeket nem állapították meg, az alább felsorolt protokoll használható kiindulási pontként.
szubsztrát (10 mM – es törzsoldat) – a szubsztrátok általában egy szerint /Treonint tartalmaznak foszforilációs hely motívumban. Kontrollként a Sigmából nyert mielin bázikus fehérjét használom, amelyet a NEB használt az ERK2 kináz kaliberálására.
ezenkívül a szubsztrátoknak nettó pozitív töltéssel kell rendelkezniük, hogy megkönnyítsék a vizsgálatban használt foszfocellulózszűrőkhöz való kötődést. A foszfocellulózpapírhoz való mennyiségi kötődéshez ajánlott legalább 2 bázikus maradék és egy szabad amino-terminális. Ha a foszforilációs hely motívuma nem ismert, általános tirozin-kináz szubsztrát használható. Például a “Myelin bázikus fehérje” (sok MAPK nem specifikus szubsztrátja). A kezdeti reakciókhoz 0,7-1,5 mM szubsztrátkoncentrációt kell használni. A szintetikus peptid foszforilezésének kinetikai paramétereinek meghatározásához peptidkoncentrációk tartománya szükséges
10x kináz puffer-5 mg/mL BSA-t tartalmaz (a kináz adszorpciójának megakadályozása érdekében a vizsgálati csőben), 150 mM Tris-Cl (pH 7,5).
ATP/MgCl2 (vásárolt Upstate Biotech – magnézium / ATP koktél # 20-113) – a törzsoldat 1-5 mM kényelmes. Vegye figyelembe, hogy a legtöbb MAPK-nak az ATP Km-értéke a 10-150 uM tartományban van, ezért a kinetikai kísérleteknél fontos az ATP telítő koncentrációjának használata a peptidek Km-jének és Vmax-jának eléréséhez.
ATP – 10 mCi/mL.
ERK2 kináz vizsgálatok
a) autoradiográfiás vizsgálat:
- a standard kináz vizsgálatot 25 ul térfogatban végezzük:
- 2,5 ul 10x kináz puffer
- 5 ul 1,0 mM MgCl2 /ATP (0,2 mM végső koncentráció)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul 10 mM szubsztrát (1.2 mM végkoncentráció)
- 1 U ERK2 kináz
- H2O – 25 ul
1. A kísérletek előtt készítsen egy koktélt, amely elegendő puffert, ATP-t és ATP-t tartalmaz a vizsgálatok befejezéséhez. Különböző szubsztrátkoncentrációjú vizsgálatokhoz a szubsztrátot hígítani kell, és külön-külön kell az egyes csövekhez adni. Miután a koktélt 1,5 ml mikrocentrifuga csövekbe adagolta, helyezze a csöveket 30 C fokos vízfürdőbe 30 percre. A reakciókat kináz hozzáadásával kell kezdeni, és hagyni kell, hogy 30 C fokon folytatódjanak.
2. A kívánt idő elteltével fejezzük be a reakciókat 2 X SDS mintapuffer hozzáadásával, majd egy gélen kifogyunk.
3. Szárítsa meg a gélt Whatman 3.0 papírra, tegye ki a száraz gélt autoradiogramnak, és tartsa a kazettát-70c2 órán át. (hosszabb expozíció esetén ellenőrizze, hogy a film ismét száraz-e, mielőtt új autoradiogramot helyezne rá).
B) kinetikus elemzés:
1. Végezze el a kináz vizsgálatot a fentiek szerint, ezúttal a szubsztrátok különböző koncentrációit használja 50 nm-től 1 mm-ig. 30 perc elteltével állítsa le a reakciót 45 ul jéghideg 10%-os triklór-ecetsav (TCA) hozzáadásával minden reakcióhoz. Vortex a reakciókat.
3. Forgassa 2 percig mikrocentrifugában (10K fordulat / perc).
4. Spot 35 ul a felülúszók rá 2,1 cm átmérőjű Whatman P81 cellulóz-foszfát szűrő körök.
6. A P81 szűrőköröket háromszor mossuk 500 ml hideg 0,5% – os foszforsavval (mosásonként 5-10 perc). A mosási lépések előrehaladását követhetjük a P81 szűrőkör eltávolításával egy üres reakcióhoz, majd Geiger-számlálóval történő ellenőrzéssel.
7. Mossuk egyszer 200 ml acetonnal szobahőmérsékleten 5 percig.
8. Hagyja a szűrőköröket szobahőmérsékleten megszáradni.
9. Helyezze a szűrőköröket szcintillációs injekciós üvegekbe, és mérje meg a 32P beépülést úgy, hogy a párnákat szárazra számolja egy szcintillációs számlálóban. Az ATP specifikus aktivitása kináz reakcióban (pl. cpm/pmol-ban) meghatározható úgy, hogy a reakció egy kis mintáját (2-5 ul) P81 szűrőkörre foltozzuk, és közvetlenül megszámoljuk (mosás nélkül). A kináz reakcióban kapott percenkénti számlálást (mínusz üres) ezután elosztjuk a specifikus aktivitással, hogy meghatározzuk a reakcióban átvitt foszfát móljait.
a szubsztrát Foszforilezésének kinetikája
a szubsztrát MAPK általi foszforilezésének kinetikai paraméterei a fenti protokoll variációjával határozhatók meg.
1. Végezzen reakciót nagy szubsztrátkoncentrációban annak megállapítására, hogy a fehérje szubsztrát.
2. Változtassa meg az enzim koncentrációját a vizsgálatban. A szubsztrát foszforilációjának arányosnak kell lennie az enzimkoncentrációval a vizsgálat körülményei között. Ezt a kísérletet használják a kinetikai vizsgálatokhoz szükséges enzim mennyiségének meghatározására is.
az arányok meghatározásához a szubsztrát foszforilezésének időbeli lefolyását kell elvégezni. Ebben az esetben készítsen nagyobb enzimreakciót (150 ul-t használunk). A kívánt időpontokban szívjunk ki 25 ul alikvotot, és helyezzük át azokat 45 ul jéghideg 10% TCA-t tartalmazó mikrocentrifugacsövekbe, és elemezzük a reakciókat a fent leírtak szerint. A szubsztrát foszforilációjának lineárisnak kell lennie az idővel, és a kinetikai állandók méréséhez a kezdeti reakciósebességet (5%) kell használni.
3. Változtassa meg a szubsztrát koncentrációját a vizsgálatban. Használja a sebesség vs. peptidkoncentráció diagramját a Km értékének kezdeti becsléséhez. Ebben a kezdeti mérésben a szubsztrátkoncentrációk széles tartományát (például 20 uM-2 mM) kell használni.
4. A Km (szubsztrát) és a Vmax meghatározásához változtassa meg a szubsztrát koncentrációját és mérje meg a foszfátátadás sebességét. A szubsztrátkoncentrációk jó tartománya a Km következő többszöröse: 0,125 x Km, 0,25 X Km, 0,5 x Km, 1,0 x Km, 2,0 x Km, 4,0 x Km, 8,0 X Km. A legjobb eredmény elérése érdekében a reakciókat három példányban kell végrehajtani.
5. A kinetikus állandókat súlyozott nemlineáris legkisebb négyzetek határozzák meg, amelyek illeszkednek a hiperbolikus sebességhez vs.iteratív programok, például NFIT (Szigeti termékek, Galveston, TX).
a RAR kiszámítása:
RAR: relatív akceptor Arány = Vmax / Km a fehérje szubsztrátként való működésének általános mértékeként definiálva.
egy adott szubsztrát RAR-ját normalizálom mielin bázikus fehérjével, azaz kiszámítom az egyes szubsztrátok RAR-értékét, majd elosztom a mielin bázikus fehérje RAR értékével (így az MBP-t 1,0-re állítom).
