Alta Fedeltà & Efficiente PCR Enzima: KOD DNA polimerasi
furiosus archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (in precedenza Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Fig. 1) è stato isolato da una sorgente calda solfataric (il fico. 2) sull’isola di Kodakara (Fig. 3) in Giappone, ed è stato identificato e caratterizzato.
Una famiglia di DNA polimerasi B (KOD DNA polimerasi) è stata trovata in questo ceppo KOD1 e mostra varie proprietà uniche (1).
-
Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
Fig. 2. Solfatara (isola di Kodakara, Giappone)
-
Fig. 3. Isola di Kodakara (prefettura di Kagoshima, Giappone)
La KOD DNA polimerasi presenta una forte attività esonucleasica 3 ‘→5 ‘ (attività di correzione delle bozze), un’attività che manca alla Taq DNA polimerasi.
Inoltre, questo enzima presenta un’eccellente processività e capacità di allungamento, mostrando una velocità di estensione cinque volte superiore (100-130 nucleotidi/secondo) e una processività 10-15 volte superiore (>300 basi) rispetto a quella di Pyrococcus furiosus (Pfu DNA polimerasi). Il tasso di allungamento di questo enzima è circa 2 volte superiore a quello della Taq DNA polimerasi (Tabella 1) (Fig. 4) (1).
Tabella 1. Proprietà della DNA polimerasi termostabile
| Proterty | Valore indicato DNA polimerasi | ||
|---|---|---|---|
| KOD DNA polimerasi | Pfu DNA polimerasi | Taq DNA polimerasi | |
| Origine | Archaea | Archaea | Batteri |
| Dedurre la massa molecolare (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| Ottimali di temperatura (ºC) | 75 | 75 | 75 |
| pH Ottimale a 75ºC | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| Termostabilità (half-life) | 95ºC,12 h 100,h 3.0 | 95ºC, 6h; 100ºC, 2.9 h | 95ºC, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Confronto dei tassi di allungamento di KOD Pfu e Taq DNA polimerasi.
Il tasso di allungamento è stato misurato in base alla lunghezza del DNA sintetizzato, utilizzando M13 ssDNA come modello a 75ºC.
Parallelamente allo studio delle attività della KOD DNA polimerasi, sono stati sviluppati anticorpi di neutralizzazione per la polimerasi e le attività di correzione di bozze (2). Questi anticorpi possono essere applicati alla “tecnologia PCR hot start” utilizzando KOD DNA polimerasi.
La struttura 3-D della DNA polimerasi è stata caratterizzata nel 2003 (Fig. 5) (3).
Fig. 5. Struttura 3-D della KOD DNA polimerasi
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus- (Codice n. KOD-201) è stato sviluppato sulla base di KOD DNA polimerasi e presenta alta fedeltà PCR (Table2).
Tabella 2. Confronto della frequenza di mutazione di ciascun enzima PCR.
| Totale basi Sequenziate | Numero di mutato basi | frequenza di Mutazione (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD -Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu DNA polimerasi | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Taq-base lunga-PCR enzima | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq DNA polimerasi | 102,708 | 145 | 141.2 |
La fedeltà è stata misurata come frequenza di mutazione sequenziando il prodotto PCR. Dopo la clonazione del prodotto PCR (2,4 kb della regione beta-globina umana), sono stati selezionati e sequenziati circa 96 cloni.
KOD FX (Codice n. KFX-101) è stato sviluppato sulla base di KOD DNA polimerasi e mostra una molto maggiore PCR tasso di successo (sulla base di efficienza e capacità di allungamento) di KOD-Plus- (Codice No. KOD-201) o altri enzimi PCR basati su Taq. KOD FX è anche efficace per l’amplificazione da campioni grezzi (ad esempio lisato di coda di topo, cellule coltivate).
Fig. 6. Amplificazione diretta da una coda di topo grezzo lisato
1,2: KOD FX
3~6: Enzimi di altre società
M: Marcatori
