- Abstract
- 1. Introduzione
- 2. Materiali e reagenti
- 2.1. Isolamento e coltivazione delle cellule epiteliali limbali umane
- 2.2. Colony Forming Efficiency Assay (CFE)
- 2.3. Test di raddoppio della popolazione cellulare
- 2.4. Estrazione di RNA e reazione a catena quantitativa in tempo reale della polimerasi
- 2.5. Colorazione immunofluorescente
- 2.6. Analisi Western Blot
- 2.7. Statistics
- 3. Risultati
- 3.1. Il fenotipo delle cellule staminali epiteliali corneali nel mezzo SR
- 3.2. Test CFE
- 3.3. PCR e Real-Time PCR Analysis
- 3.4. Colorazione immunofluorescente
- 3.5. Western Blot
- 4. Discussione
- Interessi concorrenti
- Riconoscimenti
Abstract
Le cellule epiteliali limbali possono essere mantenute sullo strato dell’alimentatore 3T3 con il terreno di coltura integrato siero bovino fetale e queste cellule sono state usate per trattare con successo la carenza Tuttavia, il siero bovino fetale contiene componenti sconosciuti e visualizza variazioni quantitative e qualitative lotto-lotto. Per migliorare lo stato della coltura, la sostituzione definita del siero di KnockOut è stata studiata per sostituire il siero bovino fetale per la coltura della cellula epiteliale limbare umana. Le cellule epiteliali limbari primarie umane sono state coltivate nel siero di KnockOut e nel siero bovino fetale hanno completato il medium, rispettivamente. Il tasso di crescita cellulare, l’espressione genica e il mantenimento delle cellule staminali epiteliali limbari sono stati studiati e confrontati tra questi due gruppi. Le cellule epiteliali limbari primarie umane sono state isolate e coltivate con successo in serie in questo nuovo siero Knockout integrato; la proliferazione cellulare e il mantenimento delle cellule staminali erano simili a quelli delle cellule coltivate in siero bovino fetale integrato mezzo. Questi dati suggeriscono che questo siero di KnockOut integrato medio è un sostituto efficiente al tradizionale siero bovino fetale integrato medio per limbal coltura cellulare epiteliale, e questo mezzo ha un grande potenziale per il mantenimento a lungo termine delle cellule epiteliali limbali, limbal epiteliale trapianto di cellule staminali, e la rigenerazione dei tessuti.
1. Introduzione
Le cellule staminali epiteliali corneali si trovano nello strato basale del limbus, una struttura ondulata e pigmentata chiamata palizzata di Vogt . Queste cellule staminali sostengono il rinnovamento continuo dell’epitelio corneale per tutta la vita e sostituiscono le cellule epiteliali corneali ferite o perse . La carenza di cellule staminali limbali (LSCD) e le malattie della superficie oculare associate possono essere trattate con successo utilizzando un autotrapianto epiteliale limbare coltivato . Il successo di questi trattamenti chirurgici dipende dall’espansione efficiente delle cellule staminali epiteliali limbari che hanno coinvolto lo strato di alimentatore 3T3 e il siero bovino fetale (FBS) nella maggior parte dei casi. Il sistema 3T3 feeder layer culture è stato creato da Rheinwald e Green ed è stato utilizzato con successo per espandere le cellule epiteliali dalla pelle umana, dal follicolo pilifero, dal limbus, dalla congiuntiva e dal tessuto della mucosa orale . Tuttavia, FBS non è ben definito e mostra sempre variazioni quantitative e qualitative lotto-lotto . FBS contiene anche componenti xenogenici potenzialmente dannosi, che possono stimolare reazioni immunologiche e trasmettere malattie animali e patogeni . Con tutte queste preoccupazioni, vi è una crescente necessità di sviluppare un terreno di coltura ben definito per sostituire il tradizionale mezzo integrato FBS.
Attualmente esistono alcuni mezzi alternativi privi di siero per la crescita delle cellule epiteliali, come il mezzo di crescita dei cheratinociti definito (KSFM™, Invitrogen, USA), il mezzo di crescita dei cheratinociti (KGM™, Clontech, USA), Epilife™ (Invitrogen, USA) e i mezzi mirati per le cellule progenitrici (PCT) (CellnTEC™, Svizzera). Questi prodotti hanno dimostrato di supportare l’espansione delle cellule epiteliali corneali. Tuttavia, hanno ancora bisogno di integratori di prodotti indefiniti, come l’estratto ipofisario bovino (BPE) o l’albumina sierica umana (HAS). E la maggior parte di questi mezzi richiede un’elevata densità di semina cellulare, che potrebbe non essere pratica per l’espansione delle cellule epiteliali corneali umane. Inoltre, le cellule staminali epiteliali corneali, che vengono rilevate come olocloni nel sistema di coltura 3T3, non possono essere mantenute in questo mezzo di coltura privo di siero a lungo termine . Ad oggi, non esiste un mezzo definito privo di siero che possa supportare l’espansione delle cellule staminali epiteliali corneali a lungo termine.
KnockOut serum replacement (SR) è una formulazione definita senza siero, progettata per sostituire direttamente FBS per il mantenimento delle cellule staminali embrionali (ESCs) e delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). È stato dimostrato che KnockOut SR fornisce condizioni di crescita coerenti per la coltura di cellule ES e iPSC e le cellule ES coltivate nel mezzo integrato KnockOut SR sono sostanzialmente meno differenziate rispetto a quelle coltivate nel mezzo integrato FBS e la trasmissione germinale non è compromessa minimamente. Date le somiglianze nei metodi di coltura delle cellule epiteliali e delle cellule ES, e alla luce del fatto che KnockOut SR sostituisce FBS nella coltura cellulare ES, qui si ipotizza che KnockOut SR possa essere usato per sostituire FBS nella coltura cellulare epiteliale limbale.
2. Materiali e reagenti
Piatti di coltura cellulare, flaconi, provette da centrifuga e pipette sierologiche sono stati acquistati da Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbecco Modified Eagle’s Medium (DMEM), Ham’s F-12, HEPES, penicillina e streptomicina, L-glutammina, 0,05% tripsina-0.La soluzione EDTA allo 02%, il kit Apice III e il kit RNeasy™ sono stati acquistati da Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Il siero bovino fetale (FBS) è stato acquistato da Hyclone (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). I fibroblasti NIH 3T3 del topo (ATCC CCL 92) sono stati ottenuti dalla raccolta di colture di tipo americano (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Il Dispase II era di Roche. L’anticorpo monoclonale (mAb) contro ABCG2 (clone BXP-21) e connexin 43 provenivano da Millipore; p63 (clone 4A4), K5 e K19 provenivano da Santa Cruz; K3 mAb (clone AE5) proveniva da ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Alexa Fluor 568-coniugato capra anti-topo anticorpo secondario era da Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). I kit GeneAmp RNA-PCR e Taqman Universal PCR Master Mix AmpErase UNG provenivano da Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomicina C, insulina bovina, transferrina umana, idrocortisone, fattore di crescita epidermico umano (EGF), tossina del colera e altri reagenti provenivano da Sigma-Aldrich (St. Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).
2.1. Isolamento e coltivazione delle cellule epiteliali limbali umane
Gli anelli cornea-limbali sono stati raccolti da cinque donatori sani subito dopo il trapianto corneale, è stato richiesto il consenso informato e il protocollo di raccolta del campione è stato approvato dall’Institutional Review Board (IRB) dell’Università di Jilin. Gli anelli cornea-limbali freschi sono stati trattati con 0,25% di Dispasi II a 4°C durante la notte e lo strato epiteliale è stato rimosso dal tessuto stroma sottostante e trattato con 0,05% tripsina-0,02% EDTA a 37°C per 15 minuti. L’attività della tripsina è stata neutralizzata dal 10% di FBS e le cellule epiteliali limbari dissociate sono state raccolte e centrifugate a 1.500 giri / min per 5 minuti. La vitalità delle cellule epiteliali è stata determinata dal trypan blue escludendo la colorazione e il numero di cellule è stato contato utilizzando l’emocitometro.
I fibroblasti di topo 3T3 sono stati mantenuti nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM, glucosio elevato) integrato con 10% FBS, L-glutammina (2 mm) e penicillina-streptomicina (50 UI/mL) e coltivato con 5% CO2 e atmosfera umidificata. Le cellule 3T3 sono state sottoculturate ogni 6 giorni quando hanno raggiunto la confluenza 80-90%. Le celle 3T3 sono state mantenute in serie e solo le celle prima del passaggio 20 sono state utilizzate per la preparazione dello strato di alimentazione. Per preparare lo strato di alimentazione, le cellule 3T3 confluenti sono state trattate con mitomicina C (10 µg / mL) per 2 ore a 37°C, lavate con PBS due volte e trattate con tripsina allo 0,05% per 5 minuti a 37°C. I fibroblasti 3T3 sono stati quindi raccolti e placcati a una densità di 30.000 cellule/cm2 un giorno prima
Le cellule epiteliali limbari umane sono state coltivate su uno strato di alimentatore 3T3 utilizzando un mezzo FAD o un mezzo di sostituzione del siero (SR). Il mezzo FAD è una miscela di DMEM e mezzo F-12 di Ham (1 : 1) contenente siero bovino fetale al 10%, L-glutammina (2 mm) e penicillina-streptomicina (50 UI/mL), fattore di crescita epidermico (10 ng/mL), insulina (5 µg/mL), adenina (0,18 mM), idrocortisone (0,4 µg/mL), tossina del colera (0,1 nM) e triiodotironina (2 nM). Il mezzo SR è una miscela di DMEM e mezzo F-12 di Ham (1 : 1) contenente il 10% di sostituzione del siero KnockOut SR, L-glutammina (2 mm) e penicillina-streptomicina (50 UI/mL), fattore di crescita epidermico (10 ng/mL), insulina (5 µg/mL), adenina (0,18 mM), idrocortisone (0.4 µg/mL), tossina del colera (0,1 nM), triiodotironina (2 nM), transferrina (5 µg/mL) e selenio (5 ng/mL). Le cellule epiteliali limbari sono state seminate su uno strato di alimentazione 3T3 ad una densità di 6.000 cellule / cm2 e coltivate con il 5% di CO2 e atmosfera umidificata. Il supporto FAD è stato cambiato ogni 3 giorni mentre il supporto SR è stato cambiato ogni 2 giorni.
2.2. Colony Forming Efficiency Assay (CFE)
Per il test CFE, 200 cellule epiteliali limbari umane provenienti da colture FAD o SR sono state placcate su una capsula di petri da 100 mm contenente uno strato di alimentazione 3T3 trattato con mitomicina C e coltivate come descritto sopra. Dopo la coltura di 12 giorni, i piatti sono stati fissati con formalina al 10% per 30 minuti a temperatura ambiente e colorati con rodamina B all ‘ 1% per altri 30 minuti. Dopo il lavaggio con acqua distillata, i numeri delle colonie sono stati contati e analizzati. L’efficienza di formazione delle colonie è stata espressa come il numero di colonie formate diviso per 200.
2.3. Test di raddoppio della popolazione cellulare
Le cellule epiteliali limbari sono state mantenute su uno strato di alimentazione 3T3 trattato con mitomicina C utilizzando FAD medium o SR medium. Le cellule epiteliali sono state tripsinizzate quando hanno raggiunto la confluenza 80-90% e sono passate ad una densità di 6.000 cellule/cm2. Le culture sono state mantenute in serie per 10 passaggi. Ad ogni passaggio, sono state raccolte cellule epiteliali limbari e sono stati contati i numeri di cellule. Il numero di doppioni di popolazione (PD) per ogni passaggio è stato calcolato secondo la seguente formula: , dove rappresenta il numero totale di celle ottenute ad ogni passaggio e rappresenta il numero di celle di placcatura all’inizio.
2.4. Estrazione di RNA e reazione a catena quantitativa in tempo reale della polimerasi
Per valutare il livello di espressione genica delle cellule epiteliali limbari, sono state eseguite PCR e PCR in tempo reale. L’RNA totale è stato estratto dalle cellule epiteliali corneali utilizzando il kit RNeasy seguendo le istruzioni del produttore. L’RNA è stato quantificato dal suo assorbimento a 260 nm e conservato a -80°C. Per sintetizzare i CDNA, è stato utilizzato 1 µg di RNA totale con il kit di trascrizione inversa Apice III. La PCR è stata eseguita utilizzando Platinum PCR master mix( Life Technology); e la PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando il SYBR Green PCR Master Mix (Roche) con i primer descritti in precedenza . Le reazioni di PCR in tempo reale sono state eseguite in triplice copia con una fase di attivazione iniziale a 95°C per 3 minuti, seguita da 45 cicli: 95°C per 30 secondi, 60°C per 30 secondi e 72°C per 40 secondi. L’espressione genica relativa è stata calcolata normalizzando la differenza nel valore di soglia del ciclo (delta Ct), i valori dei geni al valore delta Ct della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH).
2.5. Colorazione immunofluorescente
Le cellule epiteliali limbari umane sono state seminate in vetrini di coltura con strato di alimentazione 3T3 in FAD medium o SR medium. Tre giorni dopo la semina, le colture sono state fissate con paraformaldeide al 4% o acetone freddo a 4°C per 10 minuti. Dopo il lavaggio con PBS due volte, le cellule sono state bloccate con siero di capra al 5% in PBS per 30 minuti. Gli anticorpi primari del topo contro p63 (1 : 200, 4A4, Santa Cruz), ABCG2 (1 : 30, BXP-21, Millipore), K3 (1 : 400, Millipore) e connexin 43 (1: 1000, Millipore) sono stati applicati e incubati durante la notte a 4°C. L’anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor 568 è stato applicato per 1 ora dopo il lavaggio con PBS due volte. I nuclei cellulari sono stati quindi contrastati con Hoechst 33342 (1 µg/mL in PBS) per 20 minuti. Dopo il lavaggio con PBS per 3 volte, la coltura cellulare è stata montata con mezzo di montaggio (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ed esaminata al microscopio fluorescente (BX50; Olympus, Tokyo, Giappone).
2.6. Analisi Western Blot
Le cellule epiteliali limbari coltivate sono state lisate con tampone RIPA (10 mM Tris pH 7,5, 150 mm NaCl, 1% sodio desossicolato, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA e cocktail inibitore della proteasi; Roche Diagnostics) su ghiaccio per 30 minuti. La concentrazione di proteine è stata quantificata utilizzando il test di proteine dell’acido bicinchoninico (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Totale lisati cellulari (40 µg) sono stato sottoposto ad elettroforesi in 12% di pendenza SDS-PAGE gel, trasferito su membrana di nitrocellulosa (Bio-Rad), bloccato con il 5% di latte scremato in Tris-buffered saline (TBS) per 1 ora, e sondato con il mouse gli anticorpi contro il proliferare del nucleo di cellule antigene (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Millipore), o p63 (4A4, Santa Cruz, CA) per una notte a 4°C. Le membrane sono state poi lavate tre volte con TBS, incubate con goat anti-mouse IgG (1 : 5000, HRP-coniugato, Santa Cruz, CA) o di coniglio anti-IgG di capra (1 : 5000, HRP-coniugato, Santa Cruz, CA) per 1 ora a temperatura ambiente e sviluppato con substrati chemiluminescenti migliorati (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). I livelli di espressione di ABCG2, PCNA e p63 sono stati misurati utilizzando la misurazione dell’intensità semiquantitativa e normalizzati al livello GAPDH che fungeva da controllo interno.
2.7. Statistics
Riepilogo dei dati di CFE e relativa piega di PCR in tempo reale è stato riportato come means ± SD e confrontato utilizzando il test spaiato di Student con Microsoft Excel (versione 2003 / XP). I risultati dei test sono stati riportati come valori a due code, dove è stato considerato statisticamente significativo.
3. Risultati
3.1. Il fenotipo delle cellule staminali epiteliali corneali nel mezzo SR
Un totale di 5 tessuti ad anello cornea-limbale sono stati raccolti da donatori nella fascia di età di 32-65 anni. Questi tessuti sono stati conservati e trattati entro 24 ore dalla raccolta. La coltura di cellule epiteliali corneali primarie umane è stata stabilita con successo nel mezzo FAD(Figure 1(a) e 1 (b)) e nel mezzo SR(Figure 1(c) e 1 (d)). Le cellule epiteliali corneali mantenute nello strato di alimentazione SR medio + 3T3 mostravano una morfologia con piccole dimensioni e un elevato rapporto nuclei/citoplasma, che era tipica morfologia delle cellule epiteliali indifferenziate ,e le grandi cellule piatte squamose differenzianti erano raramente osservate(Figura 1 (c)). Le cellule epiteliali mantenute nel mezzo SR hanno iniziato a formare colonie 3 giorni dopo la semina (Figura 1(c)). Le dimensioni di queste colonie erano simili a quelle formate all’interno dello strato FAD medium + 3T3 feeder (Figura 1(a)), ma queste colonie erano meno strettamente compattate rispetto a quelle nello strato FAD + 3T3 feeder. Entro 7 giorni, le cellule epiteliali hanno raggiunto la confluenza nel mezzo SR con piccole dimensioni uniformi(Figura 1 (d)), che è stata osservata anche nella coltura FAD(Figura 1 (b)). In questo studio, le cellule epiteliali corneali umane potrebbero essere derivate e mantenute in uno strato di alimentazione SR medium + 3T3 per tutti e cinque i donatori. Per la coltivazione a lungo termine, le cellule epiteliali corneali umane sono state sottoculturate in serie in SR medium + 3T3 feeder layer per più di 10 passaggi (). Durante ogni passaggio, le cellule sono state tripsinizzate e raccolte quando le cellule hanno raggiunto la confluenza 80-90%; i numeri di cellule sono stati calcolati per il dosaggio del raddoppio della popolazione. Il risultato mostra che la resa delle cellule epiteliali dal mezzo SR è vicina a quella delle cellule coltivate nel mezzo FAD, come mostrato nella Figura 2(a), e questi dati sono simili ai rapporti precedenti . In sintesi, i dati presentati qui mostrano che il terreno di coltura SR + lo strato di alimentazione 3T3 trattato con mitomicina C supporta la crescita e la proliferazione clonale delle cellule epiteliali corneali umane.
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3.2. Test CFE
Successivamente abbiamo esaminato e confrontato il CFE delle cellule epiteliali corneali coltivate nei media FAD e SR. Per analizzare la CFE, le cellule epiteliali corneali coltivate in supporti SR e FAD sono state raccolte e seminate a una densità di 200 cellule per capsula di petri da 100 mm, che è stata preimpostata con strato di alimentazione 3T3 trattato con mitomicina C, e questa coltura è stata lasciata crescere per 12 giorni. Le cellule epiteliali corneali hanno iniziato a formare colonie 5-7 giorni dopo l’inizio della coltura. Come mostrato nella Figura 2 (b), dopo la coltura per 12 giorni, le cellule epiteliali corneali mantenute nel mezzo SR hanno mostrato CFE e dimensioni della colonia simili rispetto alle cellule mantenute nel mezzo FAD. Il valore CFE per le cellule epiteliali nei media SR e FAD era e, rispettivamente (Figura 2(c)). L’analisi statistica ha dimostrato che non vi erano differenze significative nell’efficienza di formazione delle colonie () e nell’area media delle colonie () tra i media SR e FAD (Figura 2, lettera c)). Abbiamo quantificato la percentuale dei tipi di colonia in base all’area delle colonie. I risultati hanno mostrato che la percentuale di colonie abortive (area di colonia <1 mm2) formata nel mezzo SR era simile a quella all’interno del mezzo FAD (). Allo stesso modo, la percentuale di grandi colonie (area di colonia >4 mm2) formata nel mezzo SR era vicina a quella nel mezzo FAD () (Figura 2(d)). Questi risultati indicano che le cellule epiteliali corneali coltivate nel mezzo SR possiedono un simile grado più elevato di potenziale proliferativo rispetto alle cellule coltivate nel mezzo FAD.
3.3. PCR e Real-Time PCR Analysis
Per studiare l’espressione genica, PCR e real-time PCR sono state eseguite su cellule epiteliali coltivate in entrambi i media FAD e SR. Pulizia gene GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. I dati della PCR mostrano che le cellule coltivate sia nel mezzo FAD che nel medio SR mostrano un’espressione di trascrizione ad alto livello del marcatore proliferativo PCNA. Le cellule in entrambi i media mostrano un’espressione positiva della citocheratina 3 e della citocheratina 12, che è coerente con la loro origine limbus. L’espressione positiva del marcatore delle cellule epiteliali dello strato basale, la citocheratina 15, è stata osservata anche in entrambe le colture. L’espressione ABCG2 e ΔNp63α è stata rilevata in entrambe le culture, sebbene l’espressione ABCG2 sia leggermente diminuita dopo la coltura primaria nel mezzo SR. Il basso livello di espressione della connexina 43 è stato osservato in entrambe le colture e implicava un basso livello di differenziazione delle cellule epiteliali in entrambi i media. Per la PCR in tempo reale, l’analisi quantitativa del livello di mRNA ha mostrato che non vi era alcuna differenza significativa di espressione () di p63 e ABCG2 tra le cellule epiteliali coltivate nei media FAD e SR (Figura 4(a)). È stata eseguita anche un’analisi in tempo reale del marcatore di differenziazione epiteliale corneale citocheratina 3 e citocheratina 12. Entrambi questi due marcatori erano appena rilevabili nelle colture cellulari FAD e SR e, sorprendentemente, non vi è alcuna differenza significativa () nel livello di espressione tra queste due culture.
3.4. Colorazione immunofluorescente
Per confermare che le cellule epiteliali coltivate nel mezzo SR mantenevano lo stato staminale e indifferenziato, è stata eseguita la colorazione immunofluorescente di diversi marcatori di proliferazione, differenziazione e cellule staminali epiteliali putative. Come mostrato in Figura 4, nel mezzo SR, la maggior parte delle cellule epiteliali mostrava una morfologia piccola e uniforme e la maggior parte delle cellule era fortemente macchiata con p63, il presunto marcatore epiteliale delle cellule staminali. Le cellule macchiate positive ABCG2 inoltre sono state osservate in una distribuzione irregolare all’interno delle colonie epiteliali limbari delle cellule. Le cellule mantenute nel mezzo SR erano debolmente colorate per la connexina 43 e la citocheratina 3. La bassa espressione di questi due marcatori di differenziazione suggerisce un basso livello di differenziazione delle cellule epiteliali nella coltura cellulare. Lo stile di colorazione simile è stato osservato anche nelle cellule mantenute con il mezzo FAD(Figura 4 (b)). Questi dati implicano che le cellule epiteliali limbali umane coltivate nel mezzo SR mantenevano un’espressione ad alto livello di marcatori di cellule staminali epiteliali putative, esprimendo un basso livello di marcatori di differenziazione.
3.5. Western Blot
Per confermare due volte l’espressione genica quantitativa e i risultati di colorazione immunofluorescente, l’espressione di potenziali marcatori di cellule staminali epiteliali (p63 e ABCG2) e marcatore di proliferazione (PCNA) è stata valutata utilizzando Western blot. Utilizzando l’anticorpo monoclonale p63 (clone 4A4, Santa Cruz), la proteina p63 (70 KD, ΔNα isoforma) è stata rilevata ad alto livello di espressione nel mezzo SR. L’espressione di ABCG2 (70 KD) è stata rilevata in ogni passaggio di cellule coltivate in mezzo SR. PCNA, marcatore di proliferazione, è stato rilevato anche in cellule coltivate in mezzo SR(Figura 3 (c)). E i livelli di espressione di p63, ABCG2 e PCNA erano simili in 10 passaggi con misurazione dell’intensità semiquantitativa(Figura 3 (d)) usando GAPDH come controllo interno.
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4. Discussione
Le cellule epiteliali coltivate su strato di alimentazione 3T3 sono state derivate con successo e utilizzate per il trattamento di varie situazioni cliniche, come gravi ustioni, ulcere del piede diabetico, difetti della pelle e difetti della mucosa orale . Il primo trapianto di cellule staminali epiteliali limbari è stato descritto nel 1997 da Pellegrini et al. . Negli ultimi decenni sono stati sviluppati diversi metodi di coltura, tra cui la coltura di cellule epiteliali limbari su membrana amniotica umana (HAM) con o senza strato di alimentazione 3T3 , la coltura di cellule epiteliali su piastre sensibili alla temperatura e la coltura di cellule epiteliali con terreno di coltura commerciale senza siero. Poiché un recente rapporto indica che l’esito clinico del trapianto di cellule epiteliali della cornea/limbus dipende dal fatto che le cellule staminali limbali siano conservate nella coltura cellulare, è stato sottolineato che gli olocloni sono stati mantenuti solo nel sistema di coltura FAD + 3T3 . Poiché questo protocollo di coltura prevede l’utilizzo di FBS, vi sono crescenti preoccupazioni per la sicurezza che FBS sia prodotti animali mal definiti e abbia il potenziale di trasmettere malattie derivate dagli animali ai pazienti . Pertanto, è sempre più necessario sviluppare un terreno di coltura privo di prodotti animali e privo di FBS per sostituire il mezzo di coltura tradizionale .
In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo mezzo di coltura senza siero, in cui KnockOut SR ha sostituito FBS. I fenotipi delle cellule staminali epiteliali limbari in questo nuovo mezzo di coltura privo di siero sono stati valutati mediante immunotenenti con anticorpi per i marcatori di cellule staminali proposti (p63, ABCG2) e marcatori di differenziazione (citocheratina 3, connexina 43).
Il fattore di trascrizione nucleare p63 è stato precedentemente proposto come un marker di cellule staminali epiteliali e ΔNα è l’isoforma predominante delle isoforme p63 in queste cellule . I nostri risultati sono coerenti con questi rapporti precedenti; la p63 nucleare è stata fortemente espressa nella coltura cellulare limbale, che è stata dimostrata da immunostenere, PCR in tempo reale e western blot. La presenza di p63 nella coltura cellulare limbale indica il loro alto potenziale proliferativo e di auto-rinnovamento. ABCG2, un membro dei trasportatori ATP binding cassette (ABC), originariamente noto come breast cancer resistant protein 1 (BCRP1), è stato proposto come un altro marcatore di cellule staminali putative per le cellule staminali adulte, comprese le cellule staminali epiteliali limbus . L’elevata espressione di ABCG2 nel mezzo SR è stata evidenziata da immunostenenti e PCR in tempo reale.
K3 e K12 sono ben noti come marcatori specifici della cornea . Coerentemente, i nostri risultati immunostenanti e PCR in tempo reale hanno mostrato che le cellule erano K3 e K12 negative, confermando la loro origine limbus. Connexin 43 è un membro della famiglia delle proteine della giunzione di lacuna; permette la diffusione diretta dei soluti a basso peso molecolare fra le cellule vicine. La connexina 43 è stata espressa da cellule epiteliali differenziate e l’assenza di queste molecole di comunicazione intercellulare può essere una caratteristica delle cellule staminali epiteliali.
Nei nostri risultati, una percentuale maggiore di cellule ha espresso p63 e ABCG2, mentre poche cellule esprimono marcatori di differenziazione K3/K12 e CX43. Così le cellule staminali epiteliali limbali umane nel mezzo senza siero SR hanno mostrato fenotipi simili e mantengono condizioni indifferenziate, rispetto al mezzo FBS.
In conclusione, utilizzando KnockOut SR che sostituisce FBS, il nostro nuovo mezzo senza siero mantiene la crescita e la proliferazione delle cellule epiteliali corneali umane e mantiene le cellule staminali epiteliali nel loro fenotipo indifferenziato. Questo nuovo metodo di coltura senza siero è definito come supplemento e relativamente facile da controllare. Ha un grande potenziale per essere utilizzato nel trapianto di cellule epiteliali limbali e nella rigenerazione dei tessuti.
Interessi concorrenti
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Riconoscimenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Jilin University e della National Natural Science Foundation of China (NSFC 30500548).
