base Strutturale per il riconoscimento di K48-collegato Ub catena proteosomale recettore Rpn13

K48-collegato Ub catena dinamicamente oscilla tra molteplici conformazioni

Abbiamo usato smFRET per valutare la disposizione spaziale dei due Ub subunità in ligando libero K48-diUb. Abbiamo introdotto fluorofori, Alexa Fluor 488 e Cy5, al N-terminale dell’Ub distale e al C-terminale dell’Ub prossimale (Fig. S1a). Utilizzando l’algoritmo di massimizzazione delle aspettazioni32, il profilo smFRET di K48 – diUb può essere meglio descritto come tre specie di TASTI sovrapposti (Fig. S2). Le specie ad alto, medio e basso TASTO sono centrate a FRET efficienze di 0,74, 0,57 e 0,23, con rispettive popolazioni di ~48, ~39, e ~13% (Fig. 1 bis). Le distanze del TASTO tra il centro dei fluorofori sono calcolate rispettivamente a ~43, ~50, ~64 Å. Pertanto, le specie ad alto, medio e basso FRET possono essere assegnate a stati compatti, semiaperti e aperti preesistenti per K48-diUb.

a Con fluorofori coniugati a 76 C sito dell’Ub prossimale e 0 C dell’Ub distale (cfr. Fig.supplementare S1a), il profilo smFRET può essere montato su tre tipi di TASTI sovrapposti. Se non diversamente indicato, questa coppia di siti di coniugazione viene utilizzata per tutti gli studi smFRET su K48-diUb. La specie ad alto TASTO (di colore rosso) corrisponde ad uno stato compatto preesistente. b – d Lo stato compatto può essere arricchito selettivamente da Rpn13 a lunghezza intera e l’aumento della popolazione può essere montato su un’isoterma legante. ad esempio, lo stato compatto può essere arricchito selettivamente da Rpn13NTD e l’aumento della popolazione può essere adattato per essere un’isoterma vincolante. h Con i fluorofori coniugati nei siti N25C / N25C, Rpn13NTD può arricchire selettivamente lo stato compatto preesistente del diUb distale di K48-tetraUb (cfr. Fig.supplementare S5), offrendo un’affinità vincolante. Le popolazioni della specie smFRET sono calcolate in media su tre misurazioni indipendenti, con gli errori che indicano 1 SD; i valori KD sono riportati come best fit ± fitting errors

La fluttuazione conformazionale di K48-diUb è stata precedentemente studiata utilizzando smFRET26. In quello studio, gli autori hanno risolto due specie smFRET per K48-diUb, vale a dire le specie ad alto e basso TASTO con efficienza del TASTO centrale a 0,69 e 0,41, rispettivamente, oltre a una specie senza tasto. Gli autori hanno dimostrato che la titolazione di un OTUB1 inattivato (OTUB1i), una deubiquitinasi specifica per K48 isopeptide linkage33, arricchisce principalmente le specie a basso FRET. La loro osservazione ha portato alla proposta che K48-diUb può essere specificamente riconosciuto da OTUB1 attraverso un meccanismo di selezione conformazionale. Qui abbiamo ripetuto la titolazione smFRET e abbiamo scoperto che OTUB1i arricchisce le specie a medio TASTO (Fig. S3a-c). Inoltre, l’aumento della popolazione della specie a medio FRET dopo la titolazione OTUB1i può essere montato su un’isoterma legante con un valore KD di 7,7 ± 0.1 µM (Fig. S3d), che è vicino al valore KD precedentemente segnalato26. Pertanto, le specie a tasti medi nel presente studio dovrebbero corrispondere alle specie a tasti bassi nello studio precedente e la discrepanza potrebbe derivare da diverse efficienze di conteggio dei fotoni e routine di adattamento delle tracce temporali smFRET.

Per confermare ulteriormente che K48-diUb fluttua tra tre stati conformazionali preesistenti, abbiamo introdotto fluorofori in coppie aggiuntive di siti di coniugazione del fluoroforo (Fig. S1b-d). Per i siti alternativi, anche se le efficienze centrali delle specie FRET differiscono, i profili smFRET possono ancora essere descritti come tre specie di FRET sovrapposte con popolazioni simili (Fig. S4). Ad esempio, per i siti di coniugazione 25 C/25 C, le specie ad alto, medio e basso FRET sono centrate su efficienze FRET di 0,68, 0,54 e 0,21, con rispettive popolazioni di ~48%, ~43% e ~9% (Fig. S4d). Pertanto, è improbabile che la coniugazione dei fluorofori perturbi la struttura proteica e le misurazioni smFRET hanno rivelato la dinamica conformazionale intrinseca di K48-diUb indipendentemente dal sito di coniugazione, cioè il K48-diUb si alterna tra tre stati distinti in assenza di una proteina partner.

Per valutare ulteriormente se le subunità Ub nella catena Ub più lunga legata a K48 fluttuano anche tra più stati conformazionali, abbiamo analizzato il profilo smFRET della tetra-ubiquitina legata a K48 (K48-tetraUb). Abbiamo coniugato i fluorofori in due siti N25C nel diUb distale (con rispetto al diUb prossimale) di K48-tetraUb. Il profilo smFRET può essere adattato anche come tre tipi di TASTI sovrapposti (Fig. S5a). Sebbene le popolazioni relative delle tre specie siano diverse da quella di un K48-diUb isolato con fluorofori coniugati negli stessi siti (Fig. S4d), le efficienze del TASTO centrale della specie del TASTO sono quasi identiche. Pertanto, gli stati conformazionali dell’unità diUb sono probabilmente conservati in una catena Ub più lunga legata a K48, mentre la differenza nelle popolazioni relative può essere il risultato dell’effetto modulatorio del diUb prossimale.

La specie ad alto FRET è selettivamente arricchita da Rpn13

Per valutare la relazione tra la dinamica conformazionale della catena Ub legata a K48 e il riconoscimento Rpn13, abbiamo titolato 150 pM K48-diUb etichettato con fluoroforo con proteina Rpn13 umana a lunghezza intera. È interessante notare che, dopo l’aggiunta di 100 nM Rpn13, la preesistente specie ad alto FRET di K48-diUb è arricchita da ~48% a ~57% (Fig. 1a, b), mentre la popolazione di specie a medio e basso TASTO diminuisce. La popolazione delle specie ad alto FRET continua ad aumentare con l’aggiunta di più Rpn13 (Fig. 1c), e l’isoterma di legame può essere montato ad un valore KD di 119 ± 24 nM (Fig. 1d).

È stato precedentemente dimostrato che Rpn13NTD è principalmente responsabile del binding UB6,7. Pertanto, abbiamo eseguito la titolazione smFRET per 150 pM K48-diUb etichettato con fluoroforo utilizzando solo Rpn13NTD comprendente solo i primi 150 residui. Rpn13NTD arricchisce anche selettivamente le specie ad alto TASTO di K48-diUb (Fig. 1e, f). L’aumento della popolazione delle specie ad alto FRET può essere adattato per permettere un valore KD di 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g), che è circa 4 volte aumento di affinità rispetto a full-length Rpn13. Se i fluorofori sono attaccati a siti di coniugazione alternativi (Fig. S1b e S4b), la titolazione di Rpn13NTD provoca anche l’arricchimento di specie di tasti equivalenti seguendo una tendenza simile, offrendo un valore KD quasi identico (Fig. S6). Pertanto, l’aspetto residui aggiuntivi possono avere un piccolo effetto inibitorio sull’interazione tra Rpn13NTD e K48-diUb.

Inoltre, abbiamo eseguito la titolazione smFRET per 150 pM K48-tetraUb con fluorofori coniugati al diUb distale (Fig. S5a). La titolazione di Rpn13NTD arricchisce selettivamente le specie ad alto FRET preesistenti del diUb distale marcato con fluoroforo (Fig. S5b-d), e l’isoterma di legame può essere montato ad un valore KD di 214 ± 70 nM (Fig. 1h). La riduzione di 7 volte dell’affinità di legame rispetto all’interazione Rpn13NTD: K48-diUb può essere attribuita all’auto-associazione tra diUb distale e DIUB prossimale 34, rendendo la superficie di legame meno disponibile per il legame Rpn13. È importante sottolineare che, per tutte le titolazioni smFRET di K48-diUb o K48-tetraUb, l’efficienza centrale delle specie ad alto TASTO cambia poco in assenza o presenza di Rpn13 o Rpn13NTD. Ciò significa che Rpn13 si lega a una conformazione preesistente di K48-diUb attraverso un meccanismo di selezione conformazionale, sia che K48-diUb sia di per sé o parte della catena Ub più lunga. Significa anche che la specie high-FRET, cioè lo stato compatto preesistente di K48-diUb, non è completamente chiusa ed è pronta ad interagire con altre proteine. È importante sottolineare che l’arricchimento selettivo delle specie ad alto ATTRITO indica anche che Rpn13 dovrebbe interagire contemporaneamente con entrambe le subunità Ub.

Rpn13 si lega preferenzialmente al diUb collegato a K48

Per valutare la specificità di legame Rpn13 per il legame K48, abbiamo valutato le affinità di legame tra Rpn13 e altri tipi di proteine Ub. Con la titolazione di 200 nM Rpn13NTD in 150 pM K48-diUb marcato con fluoroforo, la popolazione delle specie ad alto FRET aumenta del 15% da ~48% a ~63% (Fig. 1f). A questa concentrazione, il legame K48-diUb non è ancora saturo di Rpn13NTD (Fig. 1g) e pertanto, la popolazione delle specie ad alto ATTRITO è sensibile a piccoli cambiamenti della concentrazione Rpn13NTD disponibile. K48-diUb senza etichetta può competere per il legame con Rpn13NTD con K48-diUb etichettato con fluoroforo. Con l’aggiunta di 150 pM K48-diUb senza etichetta, la popolazione delle specie ad alto FRET diminuisce del 7,5%, corrispondente a un’inibizione del 50% di K48-diUb marcato con fluoroforo legato a Rpn13NTD (Fig. 2 bis). Con l’aggiunta di 300 pM K48-diUb senza etichetta, la popolazione delle specie ad alto TASTO diminuisce dell ‘ 11%, per un totale di inibizione del 73% (Fig. 2 ter). Come tale, sia fluorophore-marcato che K48-diUb non etichettato competono per la stessa interfaccia obbligatoria su Rpn13 con simile affinità obbligatoria. Ciò significa anche che la coniugazione dei fluorofori a K48-diUb causa poca perturbazione all’interazione tra Rpn13NTD e K48-diUb.

a, b L’aggiunta di 200 nM Rpn13NTD arricchisce prima le specie ad alto FRET di K48-diUb etichettate con fluoroforo (cfr. Figura 1f), e l’ulteriore aggiunta di 150 pM e 300 pM K48-diUb senza etichetta diminuisce la popolazione delle specie ad alto FRET. c, d Aggiunta di 150 pM e 300 pM monomero Ub senza etichetta ha effetto trascurabile sulla popolazione delle specie ad alto FRET. e, f, Oltre 150 pM K48-diUb e 150 pM M1-diUb causare lieve diminuzione della popolazione dell’alto-TASTO specie

Inoltre, la miscela di 200 nM Rpn13NTD e 150 pM fluoroforo K48-diUb, abbiamo aggiunto senza etichetta Ub monomero, K63 legata diubiquitin o M1-linked diubiquitin, per valutare se altri tipi di Ub in grado di spostare l’K48-diUb. La popolazione delle specie ad alto TASTO cambia poco con l’aggiunta di 150 pM o 300 pM Ub monomero (Fig. 2 quater, d). Con l’aggiunta di 150 pM K63-diUb e 150 pM M1-diUb, anche la popolazione delle specie ad alto TASTO rimane invariata all’interno dell’intervallo di errore (Fig. 2 sexies, f). D’altra parte, la titolazione diretta di 1 µM Rpn13NTD in K63-diUb coniugato al fluoroforo e M1-diUb causa pochi cambiamenti ai loro profili smFRET preesistenti (Fig. S7). Insieme, Rpn13NTD interagisce selettivamente con K48-diUb.

Struttura della soluzione di Rpn13NTD:Complesso K48-diUb

Sebbene ora abbiamo dimostrato che Rpn13NTD interagisce selettivamente con K48-diUb, è stata determinata solo la struttura complessa tra Rpn13NTD e il monomero Ub6,8. Per capire come le due subunità in K48-diUb possono interagire simultaneamente con Rpn13NTD, abbiamo deciso di determinare la struttura della soluzione di Rpn13NTD:complesso K48-diUb utilizzando la risonanza magnetica nucleare (NMR). Sulla formazione del complesso della proteina, i residui interfacciali sperimenterebbero l’ambiente locale differente e quindi visualizzerebbero i segnali di NMR. Abbiamo scoperto che, titolando K48-diUb senza etichetta a Rpn13 con etichetta 15N provoca grandi perturbazioni di spostamento chimico (CSP), che coinvolgono principalmente residui 73-83 e 93-106 (Fig. 3 bis). Questi residui formano una superficie contigua su Rpn13, che copre un’area più grande del previsto dalla struttura complessa precedentemente determinata tra Rpn13NTD e il monomere6, 7 di Ub. D’altra parte, titolando Rpn13NTD senza etichetta a K48-dUb, con Ub 15N prossimale o distale marcato e l’altra subunità senza etichetta, i CSP sono osservati principalmente per i residui nella regione β-foglio di entrambe le subunità Ub. Alcuni dei residui interfacciali scomparvero anche alla formazione del complesso (Fig. 3 ter, lettera c).

a – c CSP media su 1H e 15N dimensioni di protoni ammidici spina dorsale sulla formazione del complesso con 0,2 mm proteine isotopiche e non etichettati. Inserti: la subunità etichettata 15N è illustrata con la rappresentazione della superficie e i residui di colore rosso hanno CSP sopra la linea tratteggiata. d, e Con una sonda paramagnetica coniugata al sito E24C dell’Ub distale, sono stati valutati i rapporti di intensità tra spettri paramagnetici e diamagnetici e i valori PRE Γ2 per protoni ammidici della spina dorsale di Rpn13NTD marcato con 15N. Le scatole grigie indicavano residui con una pressione intermolecolare molto grande. f Con la sonda paramagnetica coniugata al sito N25C dell’Ub prossimale, i valori Γ2 sono stati misurati per protoni ammidici di Ub distale marcato con 15N in K48-diUb. Le barre di errore indicano 1 S. D., e i residui completamente allargati nel complesso sono denotati con stelle

Nuclear Overhauser effect (NOE) riporta la relazione di distanza (<6 Å) tra i nuclei. Inoltre, l’esperimento NMR semi-filtrato 13C può fornire NOE tra protone legato a 12C e protone legato a 13C, cioè relazione di distanza intermolecolare. Abbiamo ottenuto NOES intermolecolari tra Rpn13NTD e l’Ub prossimale, tra Rpn13NTD e l’Ub distale e tra Ub prossimale e Ub distale (Fig. S8). Inoltre, abbiamo coniugato una sonda paramagnetica maleimide-EDTA-Mn2+ nel sito E24C dell’Ub distale e raccolto paramagnetic relaxation enhancement (PRE) per protoni ammidici della spina dorsale di Rpn13NTD, seguendo il protocollo stabilito22, 35. Come valutato dal rapporto di intensità di picco degli spettri paramagnetici rispetto a quelli diamagnetici o dal tasso Γ2 di potenziamento del rilassamento trasversale, i residui Rpn13 30-42 e 101-106 sperimentano grandi PRES con grave allargamento della linea (Fig. 3d, e). Abbiamo anche coniugato la sonda paramagnetica nel sito N25C dell’Ub prossimale e valutato il tasso di miglioramento del rilassamento trasversale Γ2 per l’Ub distale (Fig. 3 septies). Grandi valori PRE sono osservati tra le due subunità Ub del K48-diUb privo di ligando e l’aggiunta di Rpn13NTD aumenta il PRES inter-Ub ma con un profilo PRE simile. Gli esperimenti PRE NMR confermano quindi che Rpn13NTD arricchisce lo stato compatto preesistente di K48-diUb.

Per perfezionare il Rpn13NTD:K48-diUb struttura complessa contro le restrizioni sperimentali, abbiamo eseguito il body docking rigido con libertà di angolo di torsione data ai residui del linker diUb e alle catene laterali dei residui interfacciali. Per i 20 conformer a energia più bassa, la deviazione radice-media-quadrato (RMS) per gli atomi pesanti della spina dorsale di tutti i residui rigidi è 0,86 ± 0,54 Å (Fig. S9 e Tabella S1). Le due subunità Ub di K48-diUb rimangono associate nel complesso, seppellendo solvent accessible surface area (SASA) di ~1130 Å2. D’altra parte, RPN13NTD si incunea, seppellendo ~940 Å2 di SASA con l’Ub prossimale e ~1300 Å2 di SASA con l’Ub distale (Fig. 4 bis). La struttura complessa tra Rpn13NTD e Ub prossimale di K48 – diUb nel presente studio è simile alla struttura complessa nota tra Rpn13NTD e Ub monomer6, 7, con la differenza RMS per gli atomi pesanti della spina dorsale 2.17 ± 0.31 Å(Fig. S10a). È interessante notare che, sebbene i residui idrofobici L8, I44 e V70 nell’Ub prossimale siano coinvolti per interagire con Rpn13, gli stessi tre residui nell’Ub distale sono sepolti nell’interfaccia Ub-Ub.

una struttura di Rpn13NTD: complesso K48-diUb. La formazione del complesso seppellisce ampie interfacce tra le subunità. b Superfici di potenziale elettrostatico di Rpn13NTD e Ub distale di K48-diUb, disegnate su scala ± 3 kBT. I residui R104 in Rpn13NTD e D39 in Ub distale sono mostrati come palle e bastoni. la mutazione di inversione di carica di c R104E in Rpn13NTD causa una diminuzione di 300 volte nell’affinità di legame per K48-diUb, come valutato da smFRET (cf. Fig.supplementare S11). Il valore KD è riportato come best fit ± fitting errors. d Le analisi Western blot mostrano che la trasfezione del mutante Rpn13 R104E (con un flag N-terminale) aumenta la quantità complessiva di proteine polyUb collegate a K48 nella cellula. le vibrazioni delle cellule e in caso di shock termico (rispetto alle cellule senza shock termico) mostrano che la trasfezione del mutante Rpn13 R104E, ma non del wildtype Rpn13, conferisce termotolleranza. * P < 0,05, * * * P < 0.001, a cellule di controllo nello stesso gruppo, non appaiati test t; ##P < 0.01, ###P < 0.001, alle cellule non trattate con la scossa di calore, one-way ANOVA; &&P < 0.01, &&&P < 0.001, per wildtype Rpn13 celle transfected con la scossa di calore, one-way ANOVA

Il Rpn13NTD:K48-diUb struttura complessa può anche essere corroborato da FRET singola molecola di dati. Sulla base della struttura complessa, abbiamo modellato i fluorofori nei loro siti di coniugazione in K48-diUb. La distanza media è 43,2 ± 5.8 Å tra i centri geometrici degli anelli aromatici fluorofori, che corrisponde ad un’efficienza teorica del TASTO di 0,73 ± 0,13 (Fig. S10b). Questo valore è quasi lo stesso dell’efficienza del centro osservata per le specie ad alto TASTO(Fig. 1 bis).

Interruzione di Rpn13NTD: l’interazione distale Ub causa l’accumulo di proteine ubiquitinate nella cellula

Nella struttura complessa tra Rpn13NTD e K48-diUb, l’interazione tra Rpn13NTD e l’Ub prossimale è simile a quella tra Rpn13NTD e il monomero Ub, come riportato in precedenza (Fig. S10a). Pertanto, abbiamo progettato esperimenti per valutare l’importanza funzionale per l’interazione tra Rpn13NTD e l’Ub distale di K48-diUb. Molti residui carichi si trovano all’interfaccia tra Rpn13NTD e l’Ub distale di K48-diUb, e quindi la forza elettrostatica può svolgere un ruolo importante per stabilizzare il complesso (Fig. 4 ter). Tra questi, il residuo D39 nell’Ub distale è vicino al residuo R104 in Rpn13. Abbiamo quindi mutato il residuo Rpn13 R104 in un glutammato e titolato il mutante Rpn13NTD in K48-diUb marcato con fluoroforo. La proteina mutante arricchisce le specie ad alto FRET di K48-diUb (Fig. S11). Tuttavia, l’affinità di legame diventa molto più debole. L’isoterma legante può essere montato su un valore KD di 10,0 ± 3,3 µM, circa 300 volte più debole del wildtype Rpn13NTD (Fig. 4 quater). Come tale, l’associazione con l’Ub distale è importante per il riconoscimento specifico tra Rpn13 e K48-diUb.

La ridotta affinità di legame del mutante R104E ci ha permesso di valutare l’importanza funzionale dell’interazione tra Rpn13 e la catena Ub legata a K48. La trasfezione transitoria di wildtype Rpn13 aumenta leggermente la quantità di proteine polyUb collegate a K48 (Fig. 4d). È possibile che, dopo la trasfezione di Rpn13, una quantità eccessiva di Rpn13 libero competa per legarsi alle proteine polyUb collegate a K48 con Rpn13 associato al proteasoma, rendendo così meno efficiente il reclutamento di proteine di substrato ubiquitinate al proteasoma. D’altra parte, la trasfezione di Rpn13 R104E mutante aumenta notevolmente la quantità di proteine polyUb K48-linked, rispetto alle cellule trasfettate con wildtype Rpn13 (Fig. 4d). Come controllo positivo, abbiamo incubato le cellule con 1 µM MG132, un potente inibitore del proteasome36. A causa del blocco della degradazione delle proteine labili, l’aggiunta di MG132 aumenta significativamente la quantità di proteine polyUb collegate a K48. Nel loro insieme, la mutazione R104E di Rpn13 può portare all’accumulo di proteine di substrato ubiquitinate. Ciò può essere attribuito all’interazione più debole tra il mutante Rpn13 associato al proteasoma e K48-diUb e K48-poyUb.

Lo shock termico può ridurre la vitalità cellulare. Abbiamo scoperto che uno shock termico di 30 minuti a 43 °C può ridurre la vitalità delle cellule HEK293 al 75%. Simile ai rapporti precedenti36, 37, abbiamo anche scoperto che il trattamento di MG132 ha un effetto protettivo sulla sopravvivenza cellulare in caso di shock termico, con la vitalità cellulare diminuita a ~90% (Fig. 4 e). Questo perché MG132 inibisce la degradazione proteasomiale, rendendo le proteine di shock termico altrimenti di breve durata più disponibili (Fig. 4d). Abbiamo anche analizzato la vitalità delle cellule colpite dal calore trasfettate con wildtype Rpn13 e non abbiamo trovato alcuna differenza significativa dalle cellule di controllo senza trasfezione Rpn13. D’altra parte, la vitalità cellulare delle cellule trasfettate Rpn13 R104E è diminuita a ~ 83% in caso di shock termico, che è significativamente superiore a quella delle cellule di controllo e delle cellule trasfettate con wildtype Rpn13 (Fig. 4 e). Ciò implica che il mutante Rpn13 ha un effetto protettivo sulla sopravvivenza cellulare in caso di shock termico, simile all’effetto di MG132. Nel loro insieme, l’interazione tra Rpn13 e la catena Ub collegata a K48 è essenziale per il riconoscimento mediato da Rpn13 delle proteine di substrato ubiquitinate da parte del proteasoma, mentre una mutazione del punto interfacciale in Rpn13 può causare l’accumulo di alcune proteine di substrato come le proteine da shock termico e conferire termotolleranza alle cellule trasfettate.

Rpn13NTD: l’interazione K48-diUb può essere mirata a modulare la funzione Rpn13

Rpn13 viene reclutato dinamicamente nel proteasoma tramite l’interazione tra Rpn13NTD e la coda C-terminale di Rpn27,13. La struttura complessa qui indica che l’interfaccia di binding su Rpn13NTD per Rpn2 è vicina ma non si sovrappone all’interfaccia di binding per l’Ub distale di K48-diUb (Fig. 5 bis). Abbiamo quindi premiscelato gli ultimi 16 residui di Rpn2 (Rpn2CTD) con Rpn13NTD o con Rpn13 a lunghezza intera con rapporto 1:1 e titolato Rpn13NTD:complesso Rpn2CTD a K48-diUb con fluoroforo. La premiscela di Rpn2CTD ha aumentato il valore KD di Rpn13NTD: K48-diUb da 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g) a 66,8 ± 13,9 nM (Fig. S12a-c e Fig. 5b), mentre è diminuito il valore KD di Rpn13: K48-diUb da 119 ± 24 nM (Fig. 1d) a 43,9 ± 12,8 nM (Fig. S12d-f e Fig. 5 quater). Pertanto, fornendo le incertezze di misura, l’associazione di Rpn2CTD causa solo una piccola perturbazione per l’affinità di legame tra Rpn13 e K48-diUb, che può anche avere a che fare con la presenza di linker e il dominio C-terminale di Rpn13.

a La superficie di legame dell’Ub distale di K48 – diUb su Rpn13NTD è adiacente alla superficie di legame di Rpn2CTD. Con Rpn13NTD-Rpn2CTD struttura complessa (PDB codice 5V1Y) sovrapposto da Rpn13NTD, Rpn2CTD è mostrato come cartone animato rosso. Rpn13 residuo K34 è vicino al C-terminale di Ub distale (mostrato come una linea tratteggiata). le affinità di legame b, c sono state ottenute da titolazioni smFRET di equimolare Rpn13NTD: Rpn2CTD o Rpn13: Rpn2CTD a K48-diUb marcato con fluoroforo. I valori di KD sono riportati come errori di adattamento±. il legame d del monomero Ub ancorato a Rpn2 probabilmente occupa la stessa superficie di legame dell’Ub distale, causando lo spostamento di quest’ultimo. e, f Gli esperimenti di concorrenza smFRET, con ulteriore aggiunta di 150 pM RPN2CTD-Ub proteina di fusione, alla miscela di 200 nM Rpn13NTD o Rpn13 full-length e 150 pM K48-diUb con fluoroforo (c. f. Figura 1c e f). L’errore indica 1 S. D. da tre misurazioni indipendenti delle popolazioni della specie smFRET

Rpn2 e Ub distale di K48-diUb occupano superfici vicine su Rpn13NTD. Pertanto, una proteina di fusione con monomero Ub aggiunto al C-terminale di Rpn2CTD può sporgere e interferire con l’interazione tra Rpn13NTD con l’Ub distale di K48-diUb (Fig. 5d). Come abbiamo dimostrato, l’aggiunta di 200 nM Rpn13NTD aumenta la popolazione delle specie ad alto FRET di 150 pM K48-diUb etichettato con fluoroforo a ~63% (Fig. 1f), mentre l’aggiunta del monomero Ub non può competere per il legame Rpn13NTD (Fig. 2 quater, d). Quando abbiamo aggiunto ulteriori 150 pM senza etichetta proteina di fusione Rpn2CTD-Ub, la popolazione di specie ad alto FRET diminuisce da ~4% a ~59% (Fig. 5 e). D’altra parte, abbiamo dimostrato che, aggiunta di 200 nM full-length Rpn13 aumenta la popolazione delle specie high-FRET di 150 pM fluorophore-etichettato K48 – diUb a ~60% (Fig. 1c). Ulteriore aggiunta di 150 pM senza etichetta proteina di fusione Rpn2CTD-Ub diminuisce la popolazione di specie ad alto FRET da ~4,5 a ~55,5% (Fig. 5 septies). Si noti che l’aggiunta di un Ub a Rpn2CTD non ha quasi alcun effetto sull’interazione tra Rpn2CTD e Rpn13NTD (Fig. S13). Pertanto, i nostri dati indicano che le interfacce di associazione Rpn2 e K48-diUb su Rpn13NTD sono vicine l’una all’altra. Ancora più importante, l’Ub ancorato a Rpn2 può bloccare fisicamente l’accesso del diUb distale a Rpn13 e indebolire l’interazione tra K48-diUb e Rpn13.