Utilizzando la tecnica DBE, abbiamo sistematicamente raccolto biopsie da tutto il tratto intestinale umano e caratterizzato la distribuzione delle cellule enteroendocrine K e L e l’espressione dei loro prodotti ormonali in individui sani e individui con diabete di tipo 2.
Come il diabete di tipo 2 implica sovrappeso/obesità e disfunzionale omeostasi del glucosio che potrebbe correlare ai cambiamenti nella intestinale K e L cellule, lo studio è stato progettato per descrivere il modello di distribuzione di queste cellule e l’espressione di alcuni dei loro prodotti nei due reclutati prospetticamente, di dimensioni simili, ben definito e abbinati a gruppi di volontari, senza i noti disturbi gastrointestinali. Utilizzando DBE, è stato possibile ottenere un numero elevato di campioni in tutto il tratto intestinale: da nove regioni anatomicamente specifiche (Fig. 1) e 7-22 ‘stazioni’ lungo il digiuno e l’ileo. Le biopsie dalle aree anatomicamente ben definite erano altamente comparabili. Esiste una maggiore incertezza per quanto riguarda le posizioni della biopsia nel digiuno e nell’ileo prossimale (posizioni della biopsia 3-9, Fig. 1) a causa della lunghezza variabile dell’intubazione e quindi del numero di campioni ottenuti tra individui. Per affrontare questo problema, abbiamo sistematicamente diviso il digiuno e l’ileo in sette regioni (vedi Metodi). Il segno di inchiostro sottomucoso posto alla massima profondità di inserimento durante l’enteroscopia anterograda è stato osservato durante l’enteroscopia retrograda in quattro individui su 24, indicando l’enteroscopia totale (Fig. 2). Si presume che la maggior parte del tratto intestinale sia stata studiata nel resto dei partecipanti come giudicato dalla lunghezza dell’intubazione raggiunta (per i dettagli, vedere il nostro documento metodologico ).
Abbiamo usato l’immunoistochimica e il conteggio cellulare per quantificare le cellule enteroendocrine e gli enzimi pro-ormoni e l’analisi dell’espressione dell’mRNA qPCR per valutare i prodotti ormonali / enzimatici. Entrambi i metodi sono ben consolidati ma pongono anche limitazioni. Un’elevata specificità degli anticorpi utilizzati nell’immunoistochimica è di grande importanza per garantire un minimo di colorazione aspecifica (falsi positivi). Di conseguenza, abbiamo scelto anticorpi ben consolidati e ben caratterizzati . Utilizzando l’immunoistochimica e il conteggio cellulare da microfotografie di biopsie a fette, gli oggetti tridimensionali (cioè le cellule enteroendocrine) vengono valutati con una tecnica di imaging bidimensionale. Una tecnica più ottimale per la valutazione della distribuzione cellulare sarebbe la stereologia, in cui viene stimata la vera densità (cioè cellule/tessuto mm3). Tuttavia, questa tecnica richiederebbe “blocchi” trasversali completi di tessuto, che è incompatibile con l’alto numero di siti di biopsia, e quindi una mappatura dettagliata del tratto intestinale negli esseri umani viventi che è stata mirata nel presente studio. Inoltre, si dovrebbe tenere conto di quanto segue. In primo luogo, la valutazione dell’espressione dell’mRNA indica l’attività delle cellule endocrine ma non fornisce una misura della produzione totale di un determinato prodotto cellulare in quanto non tutti gli mRNA vengono tradotti in un prodotto attivo finale. In secondo luogo, l’espressione è relativa poiché le trascrizioni specifiche dell’mRNA sono correlate all’espressione di un gene espresso stabilmente (vedere i metodi ESM per ulteriori dettagli). Considerando l’eterogeneità biologica del diabete di tipo 2, differenze più pronunciate potrebbero potenzialmente essere state rilevate con una maggiore dimensione del campione e l’inclusione di pazienti con disregolazione del glucosio più estesa.
Il lavoro di Sjölund et al del 1983 sulla distribuzione delle cellule enteroendocrine è il più dettagliato eseguito nell’intestino umano finora utilizzando IHS con una vasta gamma di antisieri (25 tipi) contro peptidi neurormonali intestinali noti o proposti . Tecniche minimamente invasive non erano disponibili in quel momento. Di conseguenza, i campioni sono stati recuperati da solo sette regioni: duodeno prossimale e distale, medio digiuno, ileo distale, colon ascendente, parte distale del colon trasverso o colon sigmoideo e retto. Per ogni regione, il materiale tissutale è stato ottenuto da 9-17 individui. I campioni sono stati recuperati sia durante un intervento chirurgico addominale (eseguito principalmente a causa di neoplasie maligne) sia durante esami enteroscopici che hanno coinvolto biopsie in individui con “altri disturbi gastrointestinali”, tra cui una varietà di sintomi e malattie non specificati (ad esempio “sanguinamento occulto” e “malattia del fegato”). Nel 1985, Adrian et al hanno utilizzato una tecnica di dosaggio radioimmunologico per determinare la quantità di PYY nel fondo gastrico e nell’antro, nel duodeno, nel digiuno, nell’ileo, nel colon ascendente, nel colon sigmoideo e nel retto . Campioni da ogni posizione sono stati ottenuti da 5-8 individui sottoposti a chirurgia a causa di carcinoma o ulcere gastriche. Nel 1992, uno studio che studia la distribuzione delle cellule L enteroendocrine negli esseri umani è stato riportato da Eissele et al . I campioni sono stati ottenuti da sette regioni: duodeno, digiuno prossimale e distale, ileo, colon ascendente, colon trasverso e retto. I campioni sono stati ottenuti da soli cinque partecipanti sottoposti a intervento chirurgico per carcinoma o morbo di Crohn. Nel 2005, Guedes et al hanno studiato la distribuzione di cellule GIP-, GLP-1 – e CGA-positive, rispettivamente, utilizzando IHS su campioni da ogni 20 cm dell’intestino tenue in 30 cadaveri umani .
Va sottolineato che i quattro studi sopra menzionati hanno esaminato campioni di tessuto che appaiono normali senza alcun segno di alterazioni patologiche. Tuttavia, la presenza di alterazioni maligne o infiammatorie nell’area intestinale o il rapido inizio della degradazione cellulare post mortem potrebbero aver influenzato la distribuzione e la funzione generale delle cellule enteroendocrine. Inoltre, l’eterogeneità dei partecipanti potrebbe aver influenzato i risultati.
In accordo con i nostri risultati, Sjölund et al, Eissele et al, Adrian et al e Guedes et al, rispettivamente, descritto variazione nella cellula L prodotti (GLP-1 e/o PYY) a seconda della localizzazione intestinale, con una maggiore densità/importo il digiuno e l’ileo distale rispetto al duodeno e del digiuno prossimale , e un aumento di densità e quantità da prossimale a distale del colon, con i più alti livelli nel retto . I nostri risultati supportano questo modello di distribuzione delle cellule L in individui sani e nel diabete di tipo 2, con l’aumento dell’espressione genica GCG e PYY, nonché l’aumento della densità delle cellule GLP-1 e PYY-positive, lungo l’intestino tenue e lungo il colon. Abbiamo anche osservato il più grande segnale di marcatori di cellule L (cellule PYY-e GLP-1-positive e espressione di mRNA PYY) nel retto, ad eccezione dell’espressione di GCG. Le implicazioni-se del caso-delle differenze osservate tra i gruppi (significativamente maggiore espressione di GCG e PYY nel colon di partecipanti con diabete di tipo 2 rispetto a individui sani) sono attualmente sconosciute. È ben noto che l’effetto incretina è ridotto nel diabete di tipo 2, ed è stato proposto che un difetto nella secrezione di GLP-1 indotta da nutrienti possa contribuire a spiegare questo fenomeno. Tuttavia, gli studi che studiano le risposte di GLP-1 agli stimoli nutrienti in quelli con il diabete di tipo 2 e gli individui non diabetici hanno indicato che, in generale, gli individui con il diabete di tipo 2 non esibiscono le risposte totali ridotte del plasma GLP-1 .
Abbiamo osservato una discrepanza tra i livelli di espressione GCG e la densità delle cellule GLP-1-positive lungo l’intestino. Questo sottolinea che L ‘ celle in una parte del piccolo intestino può comportarsi in modo diverso da intestinale L celle in un’altra parte dell’intestino tenue, come suggerito da Svendsen et al, che ha osservato che il pattern di secrezione delle cellule L modifiche lungo il tratto gastrointestinale nei ratti, e cioè che L cellule secernono diversi rapporti di PYY e GLP-1, con alcune secernenti solo GLP-1 . In linea con questi risultati, è probabile che più cellule L distalmente localizzate esprimano proglucagono in misura maggiore rispetto a più cellule L prossimalmente localizzate.
I nostri risultati di maggiore espressione GIP e densità di cellule GIP-positive nella parte prossimale dell’intestino tenue, sia diminuendo distalmente alla regione ileocecale in individui sani e quelli con diabete di tipo 2, sono in linea con i risultati precedenti . A differenza di Sjölund et al, che hanno scoperto che le cellule GIP-positive sono assenti dall’intestino crasso, siamo stati in grado di rilevare bassi livelli di cellule GIP-positive nella parte distale del tratto intestinale. Tuttavia, non possiamo escludere che questo sia il risultato di un legame anticorpale non specifico. Tuttavia, abbiamo osservato mRNA espressione di GIP nel colon di entrambi i gruppi, anche se a livelli molto bassi. L’espressione del GIP era significativamente maggiore nei soggetti con diabete di tipo 2 lungo l’intero tratto intestinale. Si potrebbe ipotizzare che la trascrizione del GIP sia aumentata come risultato compensativo della resistenza al GIP, cioè il ridotto effetto insulinotropico del GIP osservato in individui con diabete di tipo 2 . In linea con ciò, è stato dimostrato che i livelli di GIP a digiuno sono più elevati nei partecipanti con diabete di tipo 2 rispetto ai partecipanti di controllo non diabetici e , inoltre, è stato proposto che il GIP contribuisca all’iperglicemia osservata nel diabete di tipo 2 (principalmente a causa dell’effetto glucagonotropico del GIP) . Tuttavia, i dati riguardanti le risposte del GIP a seguito di glucosio orale o pasti misti in individui con diabete di tipo 2 sono stati incoerenti e una revisione sistematica con meta-analisi ha suggerito che le risposte del GIP postprandiale sono simili in quelli con diabete di tipo 2 e in individui sani .
Dato che la glicoproteina acida CgA è un componente delle vescicole cellulari e considerata svolgere più ruoli nel processo secretorio dei prodotti endocrini, viene utilizzata come marker generale delle cellule enteroendocrine . A differenza di Guedes et al che hanno osservato una densità costante di cellule CGA-positive lungo l’intestino tenue, il nostro studio ha mostrato un declino significativo. Inoltre, abbiamo osservato una maggiore densità di cellule CgA-positive nell’intestino tenue di individui sani rispetto ai partecipanti con diabete di tipo 2. Si potrebbe ipotizzare che il numero totale di cellule CgA-positive (cellule enteroendocrine) sia alterato nel diabete di tipo 2—sia come conseguenza dello stato diabetico di tipo 2 o, forse, contribuendo alla patogenesi del diabete di tipo 2. Abbiamo osservato un numero piuttosto elevato di cellule CGA-positive nel retto di entrambi i gruppi. Recentemente, Engelstoft et al hanno dimostrato nei topi che la CgA è stata localizzata principalmente a cellule enteroendocrine che secernono monoammine e più scarsamente a cellule enteroendocrine che secernono peptidi , forse sostenendo la proposta di Sjölund et al che le cellule enteroendocrine rettali potrebbero avere una funzione principalmente locale (paracrina) piuttosto che sistemica .
Poiché PC1/3 è noto per elaborare proormoni che portano alla formazione di GIP e GLP-1, rispettivamente, ci aspettavamo di trovare la presenza di PC1/3 lungo l’intero tratto intestinale. Abbiamo osservato rispettivamente una discrepanza che coinvolge una maggiore espressione di PCSK1/3 e densità inferiori di cellule PC1/3-positive nell’intestino tenue dei partecipanti con diabete di tipo 2 rispetto ai partecipanti sani. Come descritto sopra, questo risultato dovrebbe essere interpretato con l’opinione che alcune cellule enteroendocrine possono essere molto attive in alcune regioni e avere una bassa attività in altre regioni.
Poiché PC2 è principalmente noto per l’elaborazione del proglucagono in glucagone nelle cellule alfa pancreatiche, è stato interessante trovare l’espressione di mRNA di PCSK2 e cellule PC2-positive lungo l’intero tratto intestinale. Ciò potrebbe indicare che il glucagone è prodotto nell’intestino, come recentemente suggerito da Lund et al . In linea con ciò, si potrebbe ipotizzare che la maggiore espressione di PCSK2 nell’intestino tenue di individui con diabete di tipo 2 porti alla formazione di un eccesso di glucagone, contribuendo all’iperglucagonemia diabetica di tipo 2. Per chiarire ulteriormente questo aspetto, sono necessari studi che includano la doppia colorazione immunoistochimica.
In conclusione, la presente mappatura della distribuzione delle cellule enteroendocrine K e L e le variazioni osservate nei livelli di espressione dei loro prodotti correlati lungo il tratto intestinale umano, combinate con le differenze dimostrate tra partecipanti con diabete di tipo 2 e individui sani, forniscono un lavoro di riferimento per scienziati e medici. In combinazione con la conoscenza degli studi fisiologici sugli ormoni intestinali circolanti, i nostri dati potrebbero essere utili per capire come l’intestino contribuisce a regolare il metabolismo del glucosio e l’appetito. L’identificazione di PC2 nelle cellule enteroendocrine è interessante perché ciò potrebbe essere coerente con la formazione di glucagone nell’intestino umano. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per dimostrare questa possibilità e collegare i nostri risultati alla fisiopatologia del diabete di tipo 2.
