L’RNA totale è stato estratto utilizzando Tripure Isolation Reagent (Roche).
I campioni di RNA sono stati trattati con DNaseI privo di RNasi e purificati utilizzando il Mini Kit RNeasy (QIAGEN). L’RNA risultante è stato impoverito di RNA ribosomiale utilizzando Ribo – Zero rRNA Removal Kit (Human / Mouse / Rat) (Epicentre). L’RNA impoverito da rRNA è stato utilizzato per sintetizzare il cDNA del primo filamento utilizzando il sistema di sintesi del primo filamento Apostript® III (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, il secondo filamento è stato generato utilizzando E. coli DNA ligasi( Invitrogen), E. coli DNA polimerasi (Invitrogen), e dUTP, dCTP, dATP, e dGTP set (10 µmol ciascuno, Promega), nel secondo tampone filamento (Invitrogen). Poi i cDNA sono stati tranciati con Covaris a circa 300bp. Dopo la frammentazione, i campioni sono stati purificati con colonne MinElute (Qiagen). E le estremità sporgenti 3 ‘e 5′ dei frammenti sono stati riparati utilizzando T4 DNA polimerasi (NEB) e T4 DNA Polinucleotide chinasi (NEB) in T4 DNA ligasi buffer (NEB). Successivamente, le estremità dA sono state generate impiegando Klenow Fragment (3′->5’ exo-, NEB), nel Buffer 2 (NEB). Le reazioni di legatura dell’adattatore sono state quindi impostate utilizzando adattatori indicizzati e Ligasi rapida (NEB). I prodotti sono stati utilizzati come modello per il trattamento UNG (Fermentas) e l’amplificazione PCR utilizzando DNA polimerasi ad alta fedeltà Phusion (NEB). Le librerie sono state visualizzate su 2% E-Gel® General Purpose Agarose Gel (Invitrogen). Le librerie con codice a barre sono state sequenziate su una singola corsia di un HiSeq2500 (Illumina).
