Gli usi biocatalitici per gli enzimi sono cresciuti immensamente negli ultimi anni poiché sono ecologicamente corretti, hanno un’alta specificità, presentano chemio-regio-enantio-selettività e presentano un’ampia diversità di reazioni. Inoltre, le condizioni per ottenere e ottimizzare la produzione di enzimi in termini di nutrienti, pH, temperatura e aerazione sono facilmente controllabili nei bioreattori. I microrganismi possono anche essere manipolati geneticamente per migliorare le caratteristiche desiderabili di un biocatalizzatore. Queste caratteristiche hanno favorito la sempre crescente ricerca di processi biocatalitici . L’obiettivo del nostro studio era quello di utilizzare un processo enzimatico per ottenere idrolizzati di cheratina per i prodotti per la cura dei capelli. Attualmente, gli idrolizzati di cheratina commerciali sono ottenuti per idrolisi chimica. Il metodo proposto è rispettoso dell’ambiente e produce un idrolizzato chiaro. Al contrario, gli idrolizzati commerciali hanno un colore scuro a causa della presenza di acido. Il colore chiaro è un vantaggio quando si incorpora idrolizzato di cheratina in prodotti per capelli o cosmetici per la pelle. Le proteine del siero di latte con una massa molecolare inferiore a 10 kDa sono caratterizzate da una ridotta allergenicità. Pertanto è auspicabile ottenere frazioni con masse molecolari inferiori a 5 kDa nel processo di idrolisi . Inoltre Eremeev et al hanno dimostrato l’attività antiossidante degli idrolizzati di cheratina. Il primo passo in questo lavoro ha coinvolto la trasformazione delle piume in peptidi e amminoacidi di cheratina da peptidasi e cheratinasi prodotte dal Bacillus subtilis. La figura 3 mostra che le piume sono state degradate (90-95%) dal microrganismo dopo cinque giorni di crescita nel mezzo. Le cheratinasi e le peptidasi possono agire su altri residui di cheratina, tra cui lana e polvere di corno. Le cheratinasi vengono applicate nelle industrie dei mangimi, dei fertilizzanti, dei detergenti, della pelle e farmaceutica .
A Controllo: Bacillus subtilis in piuma contenente mezzo (tempo 0) e B Dopo 5 giorni di crescita in piuma mezzo.
Alcuni rapporti hanno descritto la produzione di cheratinasi da parte di specie di bacilli come B. subtilis KD-N2; B. pumilus KS12 , B. megaterium SN1 . Tuttavia questi lavori descrivono l’isolamento di nuovi ceppi, la produzione di mutanti e la caratterizzazione delle cheratinasi suggerendo le sue potenziali applicazioni. Nel nostro studio ci siamo concentrati sull’idrolizzato di cheratina piuma prodotto da B. subtilis, in particolare sui peptidi, e lo scopo del nostro lavoro era analizzare l’effetto dell’idrolizzato sulla fibra capillare. Diverse metodologie per l’analisi delle cheratinasi sono state utilizzate da altri autori e questa grande variabilità rende difficile confrontare i risultati. Tuttavia il ceppo nativo di Bacillus subtilis utilizzato nel presente manoscritto ha mostrato un’eccellente attività proteolitica (gelatinasi) con una produzione di 350 U/ml e 400 U/ml di cheratinasi e proteasi rispettivamente.
I peptidi di cheratina formati dalla degradazione enzimatica sono stati analizzati mediante spettrometria di massa MALDI-TOF (Matrix –assisted laser desorption /ionization-time of flight). Prima di tutto confrontando i due spettri possiamo osservare i profili distinti dei due idrolizzati. I picchi multipli corrispondenti ai peptidi con un basso peso molecolare prevalentemente nell’intervallo da 800 a 1079 m/z sono stati prodotti da Bacillus subtilis (Figura 4A). Possiamo anche osservare alcuni ioni con m / z nell’intervallo da 1171,57 a 1758,96. Mentre per la preparazione commerciale di idrolizzato di cheratina KH1, i picchi sono stati concentrati nell’intervallo da 900 a 1400 m/z come mostrato nella Figura 4(B). Picchi multipli tra 1400 e 2100 possono anche essere visti nella stessa figura. Pertanto l’idrolizzato prodotto da B. subtilis contiene peptidi con masse molecolari inferiori. Questi peptidi a basso peso molecolare possono penetrare nella fibra capillare in modo più efficiente e questa caratteristica è una differenza positiva rispetto agli idrolizzati commerciali. Un precedente lavoro del nostro gruppo che utilizzava i capelli umani come substrato ha dimostrato picchi multipli da 816 a 2080 m z z dopo 4 giorni di coltura . L’analisi di massa molecolare del surnatante di coltura prodotto dal B.subtilis ceppo SLC utilizzando piume come substrato ha rivelato che la maggior parte dei peptidi, derivati da piume di pollo, presentato una massa molecolare nel range di 500-3000 Dalton . In un termofilo Meiothermus ruber H328, l’analisi MALDI TOF di prodotti solubilizzati dopo la crescita su terreno piuma rilevato solo oligopeptidi con meno di 1.000 Dalton . Questi risultati confermano che gli enzimi microbici producono peptidi con una massa molecolare inferiore.
Analisi MALDI-TOF MS degli idrolizzati enzimatici di cheratina da cheratina piuma mediante Bacillus subitilis (A) e un idrolizzato commerciale (KH1) (B). Per i dettagli vedere Materiali e metodi.
Un’analisi preliminare degli idrolizzati enzimatici di cheratina è stata effettuata utilizzando la cromatografia a strato sottile (HPTLC) e sono stati osservati peptidi e amminoacidi con una massa molecolare inferiore come mostrato in Figura 5, corsia 2, rispetto all’idrolizzato commerciale (KH1) in corsia 3. L’amminoacido glicina nella corsia 1 è stato utilizzato come standard.
Analisi HPTLC di peptidi di cheratina dopo filtrazione mediante ultrafiltrazione nel sistema Amicon (Millipore, 1000 Dalton). 1-Amminoacido glicina. 2-Peptidi di cheratina piuma ottenuti per idrolisi enzimatica. 3-Idrolizzato commerciale (KH1).
Dopo la fermentazione, l’idrolizzato enzimatico aveva una concentrazione proteica di 3,5 mg / ml. Dopo la filtrazione il contenuto proteico è andato a1, 5 mg/ml, corrispondente ad una percentuale del 42, 8% rispetto alla proteina totale. L’idrolizzato enzimatico è stato applicato alle ciocche di capelli ad una concentrazione del 10% come descritto in Materiali e metodi e nella Figura 2.
L’idrolizzato è stato applicato utilizzando uno shampoo delicato e un balsamo-risciacquo preparato secondo le tabelle 1 e 2. La tabella 3 dimostra che c’è un aumento dell’idratazione per tutti i capelli trattati con gli idrolizzati enzimatici e con raddrizzatore a 180°C. Senza l’applicazione di calore il processo non era efficiente, suggerendo che il riscaldamento è importante per incorporare gli idrolizzati nei capelli.
Gli idrolizzati proteici, in particolare quelli con una distribuzione a basso peso molecolare-cioè < 1.000 Dalton sono noti per fornire protezione e cura efficienti ai capelli. Varie fonti di proteine sono state utilizzate per produrre idrolizzati. Proteine del grano, lana cheratina e collagene idrolizzati sono esempi che sono stati utilizzati in pelle e prodotti per la cura dei capelli personali e sono noti per conferire una migliore compatibilità, sentire, idratazione e contribuire a mantenere la struttura naturale . Nei prodotti per la cura dei capelli, i peptidi a basso peso molecolare hanno due effetti: 1) Sono in grado di penetrare nella corteccia della fibra capillare e 2) Possono promuovere un rivestimento superficiale. La penetrazione sembra essere più profonda con trattamenti più lunghi. Oltre a questo, i capelli decolorati mostrano un livello più elevato di penetrazione degli idrolizzati rispetto ai capelli di controllo non danneggiati . Queste proprietà hanno effetti benefici sulla struttura del capello sostituendo la cheratina persa e hanno anche un effetto antiaging . L’effetto del peptide di cheratina di lana sulla pelle in una formulazione acquosa o in liposoma è stato studiato da e un aumento dell’idratazione e dell’elasticità come risultato dell’applicazione del peptide di cheratina è stato osservato.
L’effetto dell’applicazione dell’idrolizzato enzimatico sulla fibra capillare è stato valutato da SEM (Figure 6, 7 e 8). Tutte le figure mostrano micrografie delle fibre dei capelli trattate e non trattate con l’idrolizzato enzimatico. Un aumento della luminosità e della morbidezza è stato osservato dall’analisi sensoriale (dati non mostrati). Tuttavia nei micrografi sono stati osservati depositi di idrolizzati di cheratina piuma nella giunzione delle cuticole di tutti i tipi di capelli. Questo deposito probabilmente collabora alla sigillatura delle cuticole. Anche il calore è essenziale per la completa sigillatura delle cuticole. La fibra colorata è stata beneficiata dagli idrolizzati quando applicata con il calore (Figura 6C, D). Gli idrolizzati aderivano maggiormente alle fibre dei capelli precedentemente colorate e raddrizzate (Figura 7C, D) indicando che la combinazione di colorazione e raddrizzamento favorisce l’azione dei peptidi di cheratina. Figura 8 (A, B) mostra che il trattamento sbiancante promosso accentuato danni alla fibra capillare. L’aspetto del bordo d’attacco delle squame cuticole indica una rottura delle squame (B). L’applicazione degli idrolizzati enzimatici con il calore ha collaborato per la sigillatura delle cuticole ma i loro bordi sono rimasti rotti (C, D).
microscopia elettronica a Scansione (SEM) analisi dei capelli colorati, B –Controllo; C, D – Dopo il trattamento con il enzimatica idrolizzati e piastra a 180°; E, F – Dopo il trattamento con il enzimatica idrolizzati senza calore. Le frecce indicano depositi di idrolizzato enzimatico piuma.
Analisi micrografica SEM di capelli colorati e stirati dopo trattamento enzimatico idrolizzato. Capelli trattati A, B – Controllo; C, D – Dopo trattamento con idrolizzati enzimatici e raddrizzatore a 180°; E, F-Dopo trattamento con idrolizzati enzimatici senza calore, Notare il deposito degli idrolizzati enzimatici sulle squame (freccia).
Immagini al microscopio a scansione elettronica ottenute da capelli decolorati non trattati (A, B) e trattati con idrolizzati enzimatici con calore (C,D) o senza calore (E,F). La freccia nera indica il deposito di peptidi dagli idrolizzati enzimatici e la freccia bianca mostra i bordi rotti della cuticola.
Quando la chimica dei capelli viene modificata, alcune delle proprietà naturali dei capelli sono compromesse. Diversi meccanismi possono causare danni alla fibra capillare. Ad esempio, gli stress ambientali e le radiazioni UV foto-ossidano le proteine. La fotoossidazione proteica porta alla scissione dei legami disolfuro che incrociano le proteine e alla rottura dei legami tioesteri, che si traduce nel rilascio di lipidi superficiali legati e nella perdita della struttura del capello. Queste reazioni portano ad un deterioramento delle proprietà dei capelli, evidenti ai consumatori sotto forma di scarsa maneggevolezza, secchezza e fragilità, perdita di lucentezza e, in casi estremi, diminuzione della forza . Alcuni trattamenti cosmetici come permanente curling, colorazione permanente, sbiancamento e rilassante / raddrizzamento sono noti per alterare le proprietà dei capelli . Anche la manipolazione cosmetica come la pettinatura e la spazzolatura quotidiana può danneggiare i capelli . Recentemente, Cao et al hanno utilizzato diverse concentrazioni del brodo di fermentazione (piume di pollo) ottenuto da Stenotrophomonas maltophilia, nei capelli. Il surnatante è stato incubato per 30 min. Il brodo è risultato protettivo per i capelli, come evidenziato dalla maggiore flessibilità e forza sia per i capelli normali che per quelli danneggiati.
Sionkowska, et al utilizzando spettroscopia UV–Vis, trasformata di Fourier, spettroscopia infrarossa (FTIR) e spettroscopia a fluorescenza, ha valutato l’influenza dell’irradiazione UV sugli idrolizzati di cheratina. Nuovi fotoprodotti si sono formati durante l’irradiazione UV degli idrolizzati di cheratina e si è osservato anche un leggero aumento delle specie di zolfo ossidato. Gli autori hanno proposto che la fotodegradazione degli idrolizzati di cheratina potrebbe essere un metodo utile per la preparazione di idrolizzati con peso molecolare inferiore. Nel presente lavoro è stato osservato un aumento dell’idratazione, della luminosità e della morbidezza nei diversi tipi di capelli dopo il trattamento con il 10% di peptidi di cheratina ottenuti dal processo di idrolisi enzimatica. L’uso delle piume, un rifiuto industriale generato dal pollame come fonte di biomassa per il processo è molto interessante perché questa materia prima è economica e viene bio trasformata in un nuovo prodotto con un valore aggregato. Attualmente, gli idrolizzati di cheratina vengono solitamente preparati da parti di animali contenenti cheratina, come piume, corna, zoccoli, capelli e lana. Gli amminoacidi aromatici (triptofano, tirosina e fenilalanina) e la cistina (aminoacido contenente zolfo) svolgono un ruolo fondamentale nella fotochimica della cheratina . Alcune industrie hanno sviluppato prodotti che utilizzano un complesso di 18 aminoacidi liberi derivati da proteine di grano, mais e soia per imitare la composizione naturale della cheratina. L’alto contenuto di aminoacidi di zolfo della soia è simile a quello dei capelli umani e della lana . Tuttavia, la cheratina è una proteina insostituibile rispetto alle sue proprietà meccaniche e protettive.
Il metodo enzimatico descritto nel presente lavoro può essere utilizzato per rifiuti/residui industriali in generale per produrre prodotti a valore aggiunto. Precedenti studi in letteratura hanno descritto l’uso di cheratinasi /peptidasi per il riciclaggio della cheratina piuma scartata dall’industria del pollame . Il presente lavoro riporta per la prima volta l’uso di peptidi di cheratina nell’industria cosmetica, specialmente focalizzati sul segmento della cura dei capelli. Tenendo conto di tutti questi fattori, il metodo enzimatico per la produzione di peptidi di cheratina per prodotti per la cura dei capelli è un metodo attraente ed ecologico con un grande potenziale all’interno dell’industria cosmetica.
