- Risultati
- L’espressione di KLF2 è ridotta con l’attivazione/differenziazione dei monociti nei macrofagi.
- KLF2 inibisce l’attivazione dei monociti e la capacità fagocitaria.
- KLF2 non inibisce il reclutamento di monociti.
- KLF2 inibisce l’infiammazione indotta da carragenina.
- Effetto del Knockdown KLF2 sull’espressione genica infiammatoria.
- KLF2 inibisce le attività del promotore NF-kB e AP-1.
- Assunzione del fattore associato al coattivatore CBP (PCAF) da parte di KLF2 come meccanismo unificante.
Risultati
L’espressione di KLF2 è ridotta con l’attivazione/differenziazione dei monociti nei macrofagi.
Per comprendere meglio il ruolo di KLF2 nella regolazione delle cellule immunitarie come monociti/macrofagi, abbiamo prima valutato l’espressione di KLF2 nei monociti umani primari. Come mostrato in Fig. 1 A sinistra, l’espressione di KLF2 è robusta nei monociti umani primari e fortemente ridotta con differenziazione in macrofagi dopo 5 giorni. L’espressione di KLF2 nella linea cellulare monocitica umana THP-1 era molto più bassa di quella nei monociti umani primari. Tuttavia, l’espressione è stata ulteriormente ridotta dopo il trattamento di queste cellule con LPS o 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetato, due agenti ben stabiliti per indurre l’attivazione o la differenziazione cellulare (Fig. 1 A destra).
Espressione di KLF2 in monociti attivati in vitro e in vivo. (A) L’mRNA KLF2 è ridotto con la differenziazione e l’attivazione dei monociti. L’analisi Northern blot è stata eseguita con 10 µg di RNA totale per corsia da monociti e macrofagi umani (a sinistra). Un’analisi simile è stata eseguita con 20 µg di RNA totale da cellule THP-1 coltivate in FBS-free per 36 h successivamente e un’ulteriore stimolazione 6-h con LPS o 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetato (a destra). (B) L’espressione di KLF2 è ridotta nei monociti da pazienti con aterosclerosi. La RT-PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita con i monociti isolati da 14 pazienti (Paziente) e 14 controlli sani di età corrispondente (Controllo). I livelli di espressione dei geni specificati sono stati normalizzati con il fattore di iniziazione della traduzione eucariotica del gene di controllo.
Successivamente abbiamo cercato di determinare se l’espressione di KLF2 è regolata nell’impostazione infiammatoria in vivo. L’attivazione monocitica è un evento fisiopatologico chiave nello sviluppo di aterosclerosi, una condizione infiammatoria cronica di basso grado, quindi abbiamo ragionato che l’espressione di KLF2 può essere ridotta in questi pazienti (11). Abbiamo esaminato un gruppo di 14 soggetti normali abbinati all’età e 14 pazienti con aterosclerosi estesa (≈50% con storia di rivascolarizzazione dell’arteria coronaria) che sono stratificati rispettivamente dai livelli più bassi e più alti del gene osteosarcoma Finkel-Biskis–Jinkins (FOS), che ha dimostrato di servire come marker di infiammazione (12). Come mostrato in Fig. 1 B, l’espressione di KLF2 è stata significativamente ridotta di ≈30% nei pazienti. Al contrario, non è stato osservato alcun effetto significativo per KLF3, KLF6, KLF11 e KLF13. Coerentemente con il nostro precedente studio, l’espressione di FOS è stata significativamente aumentata nei pazienti con malattia coronarica (12).
KLF2 inibisce l’attivazione dei monociti e la capacità fagocitaria.
In risposta a stimoli infiammatori, i monociti esprimono un aumento dei livelli di fattori proinfiammatori e citochine/chemochine e mostrano una maggiore capacità fagocitaria. Per ottenere informazioni sul ruolo di KLF2 nella funzione dei monociti, abbiamo intrapreso studi di sovraespressione. Le cellule THP-1 sono state infettate con il virus control empty (EV) o KLF2 (Ad-KLF2) per 24-48 h e quindi stimolate con LPS per 2 e 6 h. Come mostrato in Fig. 2 A, il trattamento delle cellule infette da EV con LPS (25 ng / ml)ha determinato una robusta induzione della cicloossigenasi (COX)-2, del fattore tissutale e della proteina chemoattrattante monocitaria (MCP) -1 mRNA. Al contrario, questa induzione è stata marcatamente attenuata nelle cellule infette da KLF2 (Fig. 2 Bis). Effetti simili sono stati osservati anche nella linea cellulare dei monociti di topo J774a (dati non mostrati). Inoltre, la sovraespressione di KLF2 ha fortemente inibito la secrezione di varie citochine e chemochine. Come mostrato in Fig. 2 B, la sovraespressione di KLF2 ha attenuato l’induzione mediata da LPS di fattori come CD40L (del 49,6%), proteina infiammatoria dei macrofagi 1α (48,4%), proteina infiammatoria dei macrofagi 1β (64,2%), IL-1β (55,0%), IL-8 (79,1%), TNF-α (50,2%) e MCP-1 (68,8%). Questo effetto è specifico perché nessun effetto significativo è stato osservato sui livelli di più di altri rilevanti fattori di crescita (TGFß1, fattore crescita derivato dalle piastrine, granulociti/macrophage colony-stimulating factor), citochine/chemochine (IL-4, IL-10, IL-12 p 40, IL-12 p 70, IL-1α, e IFN-γ), o matrice di alterazione degli enzimi (matrix metalloproteinase tipi 1, 2, 3 e 9) (dati non mostrati).
La sovraespressione di KLF2 inibisce l’attivazione dei monociti. (A) La sovraespressione di KLF2 inibisce l’espressione genica infiammatoria. L’analisi Northern blot è stata eseguita per fattori indicati con 10 µg di RNA totale per corsia da THP-1 sovraespresso con Ad-KLF2 (KLF2) o EV come controllo dopo stimolazione con LPS per vari punti temporali come indicato. (B) La sovraespressione di KLF2 inibisce l’elaborazione di citochine/chemochine. Un milione di cellule THP-1 per millilitro sono state infettate con adenovirus EV o KLF2 per 24 h seguite da stimolazione LPS per un ulteriore 2 h o 6 h. Dopo la stimolazione, i supernatanti di coltura sono stati raccolti e valutati da array di proteomi SearchLight/ELISA sandwich multiplex. Ogni campione è stato valutato in duplice copia, e due esperimenti indipendenti sono stati valutati per un pannello di marcatori biologici. Un risultato simile è stato osservato con diversi esperimenti. (C) KLF2 inibisce la fagocitosi. Le cellule THP – 1 infette da EV e KLF2 sono state stimolate con LPS (25 ng/ml) e un test di fagocitosi è stato eseguito come descritto in Materiali e metodi. (D ed E) KLF2 non inibisce il reclutamento monocitico. In D, viene mostrata un’analisi citometrica rappresentativa del flusso di cellule GFP-positive reclutate nella cavità peritoneale dopo l’iniezione di tioglicolato ip. La barra gated indica la percentuale di cellule GFP-positive nell’analisi. In E sono forniti i risultati riassuntivi di n = 5 topi per gruppo. (F) La ricostituzione di topi immunodeficienti come descritto nei materiali e nei metodi con cellule J774a iperespresse di KLF2 rivela un edema ridotto sia nei periodi 1-h che 2-h di infiammazione indotta da carragenina. I dati sono espressi in ± SEM (n = 4). (G) KLF2 riduce l’edema tissutale. Sezioni trasversali delle zampe iniettate con carragenina (ingrandimento×100) sono state colorate con ematossilina ed eosina. Le zampe di topi ricostituiti con monociti KLF2-sovraespressi mostrano un fluido extravasato ridotto contrassegnato da frecce. Sono indicati punti di riferimento come muscoli (M) e ossa (B). (H e I) Knockdown di KLF2 aumenta l’espressione genica proinfiammatoria. Le cellule J774a sono state trasfettate con geni target non specifici (NS) o siRNA a KLF2 (siKLF2) per 48-h valutati mediante analisi Northern blot (H) e analisi quantitativa PCR in tempo reale (I). I grafici in I rappresentano dati combinati da tre esperimenti.
Una caratteristica classica del monocita/macrofago attivato è la fagocitosi. Per determinare se la sovraespressione di KLF2 influisce sulla capacità fagocitaria dei monociti, abbiamo sovraespresso KLF2 o control (EV) nelle cellule THP-1, stimolate con LPS e valutato la capacità di queste cellule di assumere bioparticelle di zymosan A marcate in rosso Texas. Come mostrato in Fig. 2 C, le cellule infette da virus di controllo hanno ingerito le bioparticelle di zymosan. Al contrario, l’assorbimento da parte dei monociti che esprimono KLF2 è stato marcatamente ridotto (Fig. 2 C). Presi insieme, questi dati dimostrano che KLF2 può inibire la secrezione monocitica di citochine / chemochine e fagocitosi.
KLF2 non inibisce il reclutamento di monociti.
Abbiamo quindi cercato di valutare l’effetto di KLF2 sulla funzione dei monociti in vivo. In risposta a una lesione o uno stimolo infiammatorio, i monociti vengono reclutati dal flusso sanguigno ai tessuti. Per prima cosa abbiamo intrapreso studi per valutare se il reclutamento di monociti è stato alterato dall’espressione di KLF2. Per ridurre al minimo il contributo di altri tipi di cellule abbiamo usato topi C. B-17-Scid-beige che sono carenti di cellule T, B e natural killer. Questi animali (n = 5 per gruppo) sono stati quindi sottoposti a irradiazione totale del corpo e ricostituiti con cellule J774a infettate adenoviralmente con virus di controllo (EV) o KLF2 mediante iniezione della vena della coda (descritta in Materiali e metodi). Gli animali sono stati quindi sottoposti a iniezione IP di tioglicolato (un potente irritante chimico che induce il reclutamento di monociti) e il numero di cellule GFP-positive è stato valutato 48 h più tardi mediante analisi citometrica a flusso. Come mostrato in Fig. 2 C e D, KLF2 non ha inibito il reclutamento di monociti GFP+ J774a nella cavità peritoneale. In effetti, abbiamo osservato in modo riproducibile che gli animali trasdotti da KLF2 mostravano un aumento significativo delle cellule GFP+. Questi dati suggeriscono che KLF2 non inibisce, ma piuttosto aumenta il reclutamento monocitico in un sito infiammatorio.
KLF2 inibisce l’infiammazione indotta da carragenina.
Dopo il reclutamento e la migrazione nei tessuti, i monociti secernono citochine, chemochine e fattori di crescita per perpetuare la risposta infiammatoria. Come mostrato in Fig. 2 B, abbiamo notato che la sovraespressione di KLF2 attenuava l’elaborazione di diverse citochine e chemochine. Per determinare se KLF2 influisce sulla funzione proinfiammatoria monocitica, abbiamo utilizzato un modello ben consolidato per l’infiammazione: l’iniezione del footpad indotta da carragenina. L’iniezione di questa sostanza chimica ha dimostrato in precedenza di indurre riproducibilmente una risposta infiammatoria caratterizzata da edema della zampa (13-15). I topi C. B-17-Scid-beige (n = 4 per gruppo) sono stati irradiati come descritto sopra, ricostituiti con cellule di controllo o J774a che esprimono KLF2 e quindi sfidati con l’iniezione di carragenina nel footpad (descritto in Materiali e metodi). Il volume della zampa è stato determinato utilizzando un idropletismometro modificato per piccoli volumi (Ugo Basile, Milano). Come mostrato in Fig. 2 F, gli animali infetti da EV hanno mostrato un aumento del volume della zampa di 17 ± 1,08-mm3 e 23,3 ± 3,05-mm3 dopo 1 e 2 ore di iniezione di carragenina, rispettivamente. Al contrario, gli animali ricostituiti con cellule J774a che esprimono KLF2 hanno mostrato solo un aumento del volume della zampa di 6,25 ± 0,85-mm3 e 7,5 ± 0,95-mm3 rispettivamente a 1 e 2 ore dopo l’iniezione di carragenina (Fig. 2 F). Coerentemente con questo effetto grossolano, l’analisi istologica delle zampe ha rivelato una riduzione dello stravaso del fluido, che porta alla formazione di edema (Fig. 2 G, frecce).
Effetto del Knockdown KLF2 sull’espressione genica infiammatoria.
Per determinare l’importanza di KLF2 nell’espressione genica infiammatoria monocitica, sono stati intrapresi anche studi di knockdown mediati da piccoli RNA interferenti (siRNA). Come mostrato in Fig. 2 H, rispetto alle cellule non trattate (di controllo) e non specifiche trattate con siRNA, l’abbattimento di KLF2 (≈60%) nelle cellule J774a ha determinato un’induzione di geni infiammatori come MCP-1 e un effetto più modesto sui livelli di espressione del fattore tissutale e della COX-2. Questi risultati sono stati verificati anche con l’analisi PCR in tempo reale (Fig. 2 I).
KLF2 inibisce le attività del promotore NF-kB e AP-1.
KLF2 può inibire potentemente l’induzione mediata da LPS di MCP-1, COX-2 e fattore tissutale (Fig. 2 Bis). L’induzione di questi obiettivi da stimoli proinfiammatori è nota per essere regolata da percorsi trascrizionali come NF-kB e AP-1. Abbiamo ragionato che, in linea di principio, KLF2 può inibire questi percorsi a più livelli come l’espressione, il legame del DNA o l’induzione dell’attività trascrizionale.
Per prima cosa ci siamo concentrati su NF-kB dato il suo ruolo centrale nell’infiammazione. La sovraespressione di KLF2 non ha alterato l’accumulo nucleare di p65 o i livelli nucleari di IKB chinasi (IKK) α e IKKy (Fig. 3 Bis). Inoltre, la sovraespressione di KLF2 non ha alterato la cinetica della fosforilazione o della degradazione di IkB o dei livelli citoplasmatici di IKKa, IKKß e IKKy (Fig. 3 B). Coerentemente con queste osservazioni, KLF2 non ha influenzato il legame NF-kB al DNA. Come mostrato in Fig. 3 C, il trattamento delle cellule infettate dal virus di controllo (EV) con LPS ha indotto una singola banda principale. Gli studi di concorrenza e supershift hanno verificato che questa banda rappresenta NF-κΒ. Un modello quasi identico di legame NF-kB è stato osservato nelle cellule di sovraespressione di KLF2. Per valutare se KLF2 può influenzare l’attivazione trascrizionale mediata da NF-kB, sono stati effettuati saggi gene reporter. Come mostrato in Fig. 3 D, trasfezione di p65 con un’attività trascrizionale indotta da plasmide reporter luciferasi NF-kB di ≈11 volte. Questa induzione è stata fortemente ridotta in presenza di KLF2, indicando che KLF2 inibisce l’attività trascrizionale NF-kB. Effetti simili di KLF2 sono stati osservati per la via AP-1 (Fig. 5 A-C, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web PNAS).
KLF2 inibisce l’attività trascrizionale NF-kB. (A e B) KLF2 non altera l’espressione dei componenti della via NF-kB. Le cellule THP-1 sono state infettate con l’adenovirus (EV o KLF2), stimolate con LPS per 30 min, 1 h o 2 h e valutate per l’espressione dei fattori indicati mediante analisi Western blot utilizzando estratti nucleari e citoplasmatici. (C) KLF2 non influisce sul legame del DNA NF-kB. Le cellule THP-1 sono state infettate con l’adenovirus (EV o KLF2) e stimolate con LPS per 1 h, e gli estratti nucleari sono stati utilizzati per i test di gel-shift. La banda NF-kB è indicata da una freccia. La specificità è stata verificata da studi di concorrenza e supershift. (D) KLF2 inibisce la transattivazione mediata da p65 del concatemer NF-kB. Studi di trasfezione transitoria sono stati eseguiti in cellule RAW264.7 con i costrutti indicati. Questi esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia e ripetuti almeno tre volte.
Assunzione del fattore associato al coattivatore CBP (PCAF) da parte di KLF2 come meccanismo unificante.
Presi insieme, i risultati in Fig. 3 indicano che KLF2 può inibire la transattivazione mediata da NF-kB indipendentemente dagli effetti sul legame del DNA di questi fattori. Un possibile meccanismo è il reclutamento di coattivatori critici. Per esempio, il legame ottimale di NF-kB richiede l’interazione con parecchi coactivator chiave quali il coactivator steroide del ricevitore (SRC)-1, PCAF e p300/CBP. KLF2 può interagire con uno o più di questi fattori, reclutarli lontano da NF-kB e, di conseguenza, ridurre l’attività trascrizionale mediata da NF-kB.
Per determinare il ruolo del PCAF nell’inibizione mediata da KLF2 dell’attività trascrizionale NF-kB abbiamo eseguito studi di cotransfezione con PCAF esogeno. Trasfezione di PCAF (ma non p300; dati non mostrati) ha salvato in modo significativo la repressione mediata da KLF2 del concatemer NF-kB (Fig. 4 Bis). Un salvataggio parziale è stato anche osservato sulla capacità di KLF2 di inibire l’attività trascrizionale AP-1 (Fig. 5D). Per determinare se KLF2 e PCAF interagiscono tra loro, abbiamo eseguito test GST pull-down e coimmunoprecipitazione. Utilizzando prodotti trascritti e tradotti in vitro, abbiamo scoperto che KLF2 e PCAF possono interagire direttamente in un sistema senza cellule (Fig. 4 B). Per sapere se PCAF si lega a KLF2 in vivo, abbiamo sovraespresso KLF2 (etichettato con emoagglutinina) e PCAF (etichettato con flag) nelle cellule COS-7. L’immunoprecipitazione con un anticorpo anti-Flag seguito da Western blotting con un anticorpo anti-emoagglutinina ha mostrato che KLF2 si lega con PCAF nelle cellule (Fig. 4 C).
KLF2 interagisce direttamente con PCAF. (A) La sovraespressione PCAF salva l’inibizione mediata da KLF2 dell’attività trascrizionale NF-kB. Studi di trasfezione transitoria con i plasmidi indicati sono stati eseguiti in cellule RAW264.7 come precedentemente descritto (n = 9-12 per gruppo). (B) KLF2 interagisce con PCAF in un sistema senza cellule. Gli esperimenti di legame sono stati eseguiti utilizzando prodotti trascritti e tradotti in vitro (TNT) di PCAF e GST-KLF2. I dati autoradiografici (superiore) e la colorazione Coomassie del gel (inferiore) indicano la quantità di carico e la proteina PCAF (∗). L’ingresso è il 2% del PCAF-TNT. (C) KLF2 e PCAF interagiscono nelle cellule. Le cellule COS-7 sono state trasfettate con i costrutti indicati e gli studi di immunoprecipitazione sono stati eseguiti come descritto in Materiali e metodi. (D) KLF2 riduce l’assunzione di PCAF. Le cellule THP-1 sono state infettate con virus contenenti Ad-KLF2 o EV e stimolate con LPS, e sono stati eseguiti saggi di CHIP per i fattori indicati sul promotore COX-2 (vedere Materiali e metodi per i dettagli).
Per determinare se i meccanismi alla base degli effetti osservati sono operativi in vivo, abbiamo intrapreso studi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Come previsto, la stimolazione LPS delle cellule THP-1 ha portato al reclutamento di p65 e PCAF al promotore COX-2 (Fig. 4 D). Inoltre, è stata osservata acetilazione concomitante di HH3 e HH4. Tuttavia, nel contesto della sovraespressione di KLF2, il reclutamento di PCAF e l’acetilazione degli istoni sono entrambi fortemente attenuati (Fig. 4 D). Coerentemente con i nostri test gel-shift, non è stato osservato alcun effetto significativo di KLF2 sul reclutamento di p65.
