Ingegneria chimica e biomolecolare

Paul Kenis Research

Sistemi microchimici: microreattori, celle microfuel e strumenti microfluidici

Kenis Research Group

Nel gruppo di ricerca Kenis, sfruttiamo la capacità di un controllo squisito sui fenomeni di trasporto alla microscala per studiare i fenomeni fondamentali (tra cui la chimica delle proteine, la biologia cellulare) e per sviluppare nuove tecnologie per una gamma di applicazioni, tra cui la conversione di energia, la sintesi chimica e gli studi biologici fondamentali. Per condurre ricerche in queste aree interdisciplinari, abbiamo sviluppato competenze di base nella caratterizzazione di sistemi elettrochimici, microfabbricazione, tecnologie microfluidiche, nonché modellazione analitica e computazionale dei fenomeni di trasporto e tecniche di caratterizzazione analitica e materiale come vari tipi di spettroscopia e microscopia.

Attualmente il gruppo persegue progetti di ricerca nei seguenti settori:

1. Sistemi elettrochimici per la conversione dell’anidride carbonica e celle a combustibile
2. Piattaforme microfluidiche per la cristallizzazione di proteine e prodotti farmaceutici
3. Piattaforme microfluidiche per lo studio dei processi inter e intra-cellulari
4. Microreattori per sintesi chimica
5. Tecnologie di produzione per microfluidica
6. Progetti ” bio ” microfluidici emergenti

1. Sistemi elettrochimici per la conversione di anidride carbonica e celle a combustibile

1a. Riduzione elettrochimica di CO2:

I livelli di CO2 nell’atmosfera sono in costante aumento, il che ha portato ad un impatto negativo sul clima globale. Strategie multiple, come la cattura e il sequestro del carbonio, il passaggio a combustibili più puliti, l’espansione dell’utilizzo di fonti di energia rinnovabili e l’aumento dell’efficienza energetica degli edifici, devono essere impiegate contemporaneamente per frenare questo aumento. La riduzione elettrochimica di CO2 in prodotti chimici a valore aggiunto o loro intermedi è un altro approccio per affrontare questa sfida. Questo processo può essere guidato dall’eccesso di potenza proveniente da fonti rinnovabili intermittenti, fornendo così un mezzo per immagazzinare l’energia rinnovabile intermittente in eccesso riciclando contemporaneamente la CO2 come vettore energetico. Inoltre, utilizzando la CO2 come materiale di partenza per la produzione chimica, la dipendenza della società dai combustibili fossili è ridotta.

Per la riduzione elettrochimica di CO2, il nostro gruppo mira a migliorare la selettività del prodotto, l’efficienza energetica e il tasso di conversione attraverso lo sviluppo di nuovi catalizzatori, l’applicazione di elettroliti idonei e l’ottimizzazione della struttura degli elettrodi e della progettazione del reattore. Ad esempio, abbiamo ridotto la cella overpotential a meno di 0.2 V utilizzando una soluzione acquosa contenente 1-etil-3-metilimidazolio tetrafluoroborato (EMIM BF4), che presumibilmente stabilizza un intermedio di reazione (Rosen et al. Scienza, 2011). Abbiamo anche sviluppato catalizzatori organometallici a base di argento che mostrano un’elevata attività catalitica a basso carico Ag (Thorson et al., J. Am. Chimica. Soc., 2012). Come materiale di supporto, TiO2 viene utilizzato per ridurre al minimo la dimensione delle particelle Ag e aumentare l’attività del catalizzatore, con un conseguente carico di Ag drasticamente inferiore senza sacrificare le prestazioni verso la riduzione di CO2 a CO(Ma et al., ChemSusChem, 2014). Inoltre, la progettazione della struttura dello strato catalizzatore fornisce un approccio per massimizzare l’utilizzo del catalizzatore e le prestazioni complessive. Un metodo automatizzato di deposizione del catalizzatore aerografato ha portato a prestazioni elevate sulla riduzione di CO2 con un carico ridotto del catalizzatore mentre l’evoluzione indesiderata di H2 è stata soppressa (Jhong et al., Adv. Energia Mater., 2013).

Attualmente continuiamo a perseguire la ricerca verso catalizzatori, elettrodi e condizioni operative migliori per la conversione elettrochimica della CO2 in sostanze chimiche di interesse. Alcuni di questi lavori sono in collaborazione con altri: Nakashima, Lyth a Kyushu, Giappone; e ricco Masel a materiali diossido.

1b. Celle a combustibile:

(2) Piattaforme microfluidiche per la cristallizzazione di proteine o prodotti farmaceutici

La cristallizzazione di proteine e prodotti farmaceutici può diventare rapidamente molto costosa a causa delle grandi quantità di materiale necessario per lo screening per condizioni ottimali di cristallizzazione. Nonostante la disponibilità di strumenti di screening robotici automatizzati di cristallizzazione in grado di utilizzare gocce di dimensioni nanolitre, il grande investimento in capitale richiesto rende tali strumenti pratici solo a pochi laboratori o centri di cristallizzazione ben finanziati. Le nostre piattaforme microfluidiche per la cristallizzazione proteica e farmaceutica (i) consentono uno screening ad alto rendimento e l’ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione utilizzando pochi nanolitri per studio; (ii) sono un’alternativa semplice da usare e conveniente ai robot di cristallizzazione per il laboratorio medio; e (iii) sono compatibili con le tecniche analitiche mediante un’appropriata selezione dei materiali (ad esempio, elevata trasmissione di raggi X, UV e IR). Essendo raggi X trasparenti, i nostri chip possono essere montati direttamente in un fascio di raggi X per la raccolta dei dati bypassando la fase di raccolta manuale dei cristalli. Le nostre piattaforme microfluidiche consentono studi di scienza fondamentale della cristallizzazione (semina cristallina, nucleazione e tassi di crescita) e di scienza applicata (analisi strutturale, screening in forma solida) sia per la cristallizzazione proteica che farmaceutica.

2a. Cristallizzazione delle proteine di membrana:

Le proteine di membrana (MPs) risiedono all’interno della membrana cellulare e fungono da mediatori per la trasduzione del segnale, dell’energia e del materiale dentro e fuori dalla cellula. Non sorprende che il malfunzionamento delle proteine di membrana sia stato collegato a numerose malattie (Quick e Javitch, PNAS, 2007). I PARLAMENTARI sono quindi obiettivi comuni della droga. Varie analisi hanno indicato che i MPS costituiscono quasi il 30% delle proteine codificate nei genomi di Escherichia coli, Saccharomyces cerevisae e Homo sapiens (Seddon et al., Bba-Biomembranes, 2004). Nonostante la loro preponderanza schiacciante nella cellula, i MPS rappresentano meno dell ‘ 1% delle strutture proteiche depositate nella Banca dati delle proteine. La determinazione della struttura delle proteine di membrana è stata ostacolata dalle difficoltà nell’ottenere quantità sufficienti delle proteine a causa della bassa abbondanza e della loro intrinseca anfifilicità e successive difficoltà nella cristallizzazione. Nel nostro gruppo abbiamo sviluppato piattaforme microfluidiche trasparenti a raggi X per la cristallizzazione in surfo e in meso MP. Inoltre, la nostra ricerca include piattaforme trasparenti a raggi X che consentono lo studio di diagrammi di fase cubici lipidici e screening a matrice di microseed, due tecniche di cristallizzazione potenti ma tipicamente inaccessibili per le proteine di membrana. L’obiettivo generale della nostra ricerca è quello di cristallizzare cristalli grandi e ben ordinati (“qualità di diffrazione”) per l’analisi a raggi X e la delucidazione della struttura. Abbiamo cristallizzato diversi obiettivi e risolto le loro strutture utilizzando i dati raccolti esclusivamente su chip Gli sforzi attuali sono focalizzati sulla cristallizzazione delle proteine della membrana respiratoria in collaborazione con il Prof. Robert Gennis, Dipartimento di Biochimica.

2b. Screening in forma solida di prodotti farmaceutici candidati:

Durante le prime fasi della scoperta di farmaci farmaceutici, gli scienziati cercano forme solide di ingredienti farmaceutici attivi (API) che hanno proprietà fisiche e chimiche appropriate (cioè solubilità, biodisponibilità, stabilità) che possono successivamente spostarsi attraverso la pipeline di sviluppo del farmaco. Sfortunatamente, il successo nel trovare una forma solida cristallina di un’API con proprietà ottimizzate utilizzando procedure di screening convenzionali (piastre del pozzo) è limitato da una piccola quantità di API disponibili durante le prime fasi della scoperta del farmaco. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato microfluidica piattaforme per la farmaceutica solida forma di screening, con l’obiettivo di (i) ridurre la quantità di ingredienti farmaceutici attivi (Api), necessari per la forma solida di screening, (ii) aumentare la compatibilità tra forma solida piattaforma di screening e gli strumenti analitici, e (iii) determinare se un approccio di microfluidica a forma solida di screening permette per la delucidazione di nuove forme solide. Abbiamo convalidato piattaforme microfluidiche basate sulla diffusione dell’interfaccia libera (Thorson et al., LOC, 2011) e evaporazione controllata (Goyal et al., LOC, 2013) che riducono la quantità di API necessaria per condizione di screening in forma solida di un ordine di grandezza (da 5 mg a 5 µg per ciascuna condizione), con risultati comparabili agli esperimenti tradizionali di screening in forma solida basati sull’evaporazione. La riduzione della quantità di campione consente agli scienziati di eseguire schermi di forma solida in precedenza nel processo di scoperta del farmaco quando sono disponibili quantità minime di API e consente uno schermo più ampio che consente la scoperta di nuove forme solide. Abbiamo progettato le piattaforme microfluidiche per essere otticamente trasparenti consentendo una facile identificazione dei solidi cristallini e per mostrare un segnale minimo nella spettroscopia Raman e nella diffrazione dei raggi X consentendo l’identificazione su chip di forme solide (Goyal et al., Crys. Crescita & Des., 2012). Attualmente, stiamo perseguendo la ricerca verso la risoluzione di strutture cristalline di cocristalli sconosciuti utilizzando la nostra piattaforma microfluidica per far crescere cristalli di qualità di diffrazione. Questo lavoro è in collaborazione con AbbVie.

(3) Piattaforme microfluidiche per studi cellulari

Le piattaforme microfluidiche forniscono diverse caratteristiche che facilitano meglio lo studio dei processi cellulari e intercellulari rispetto alle tradizionali tecniche basate su piastre di petri o su piastre di pozzo. Gli esempi includono la capacità di studiare singole cellule in ambienti altamente controllati, un controllo superiore sul microambiente cellulare nello spazio e nel tempo e una comoda integrazione con diversi tipi di microscopia. Nel nostro gruppo sviluppiamo piattaforme microfluidiche per le seguenti applicazioni:

3a. Test di sensibilità agli antibiotici:

Il trattamento efficace delle infezioni cliniche dipende in modo critico dalla capacità di esaminare rapidamente i campioni dei pazienti per identificare la suscettibilità dei patogeni infettivi agli antibiotici. I metodi esistenti per i test di suscettibilità agli antibiotici (AST) soffrono di diversi problemi, tra cui tempi di consegna lunghi (giorni), consumo eccessivo di campioni e reagenti, scarsa sensibilità al rilevamento e limitate capacità combinatorie. Questi fattori precludono la somministrazione tempestiva di antibiotici appropriati, complicando la gestione delle infezioni e esacerbando lo sviluppo della resistenza agli antibiotici.

Per affrontare questi problemi, sviluppiamo piattaforme microfluidiche per AST che offrono diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali, tra cui una maggiore sensibilità di rilevamento, risultati rapidi (<6 ore), consumo ridotto di reagenti e risultati più quantitativi. Ad esempio, in collaborazione con il Prof. Schroeder abbiamo utilizzato le nostre piattaforme microfluidiche per studiare la suscettibilità di vari batteri patogeni, come E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae, contro diversi antibiotici (Mohan et al. Bioseni. & Bioelect., 2013). Abbiamo anche utilizzato la piattaforma per studiare l’interazione tra diverse specie di batteri (colture polimicrobiche) e l’effetto di queste interazioni sulla suscettibilità agli antibiotici. Attualmente, stiamo applicando la piattaforma microfluidica in combinazione con l’utilizzo dei dati sperimentali risultanti per la modellazione farmacocinetico – farmacodinamica (PK/PD) per fornire informazioni migliori sul modo migliore per trattare una data infezione.

3b. Studiare le cellule in condizioni di ossigeno controllate:

Quando i tumori crescono verso l’esterno lontano dall’architettura vascolare locale, la formazione di regioni ipossiche variabili (ossigenazione del tessuto sub-fisiologico) si verificano in tutta la massa solida. Queste regioni ipossiche sono state associate a resistenza terapeutica, riprogrammazione metabolica e transizione epiteliale-mesenchimale. Rimangono molte domande sugli effetti dell’ipossia su questi risultati, ma solo pochi metodi consentono sia un controllo preciso sulla concentrazione di ossigeno che l’imaging in tempo reale del comportamento cellulare. Le piattaforme microfluidiche sono particolarmente adatte per controllare la concentrazione di ossigeno consentendo l’imaging in tempo reale grazie al loro controllo sulle condizioni chimiche temporali e spaziali. Oltre al controllo del microambiente locale, la scala di lunghezza ridotta nelle piattaforme microfluidiche rispetto ai metodi convenzionali fornisce tempi di equilibrio più brevi. Utilizzando i vantaggi delle piattaforme microfluidiche, abbiamo sviluppato un dispositivo schierato in grado di controllare la concentrazione di ossigeno dallo 0,5% al 21%. In collaborazione con il professor Rex Gaskins (Dipartimento di Scienze Animali), utilizziamo queste piattaforme per studiare i cambiamenti in tempo reale del potenziale redox organellare nelle cellule tumorali sotto ipossia.

(4) Sintesi chimica in microreattori

I microreattori offrono diversi vantaggi per lo studio e l’effettiva esecuzione della sintesi chimica rispetto ai tradizionali approcci “wet-lab”. Ad esempio, piattaforme più piccole e progettate con precisione forniscono un maggiore trasferimento di calore e massa, un consumo ridotto di reagenti e sono più suscettibili all’automazione. Nel nostro gruppo sviluppiamo microreattori per le seguenti applicazioni:

4a. Sintesi di radiofarmaci:

I radiofarmaci sono una classe di farmaci utilizzati nella diagnosi e nel trattamento di diverse malattie e disturbi, tra cui alcuni tipi di cancro e malattie cardiache. Le quantità dei precursori per la sintesi di questi farmaci sono in genere piccole (pochi microlitri) a causa della disponibilità limitata, dei costi elevati e dei limiti superiori alla quantità di radioattività che può essere gestita in modo sicuro. L’incapacità dei metodi convenzionali “wet-lab” di manipolare in modo efficiente bassi volumi di reagenti non solo porta alla sintesi di farmaci di bassa qualità per applicazioni cliniche, ma ostacola anche lo sviluppo di nuovi farmaci. Cerchiamo di affrontare questi problemi sviluppando tecnologie microfluidiche, o meglio microreattori, per la sintesi di questi radiofarmaci. Integrando diversi moduli microfluidici, immaginiamo che questi composti possano essere realizzati in modo molto più affidabile e ad una maggiore resa.

Abbiamo dimostrato che le tecnologie microfluidiche offrono diversi vantaggi per ogni fase rispetto ai metodi convenzionali, tra cui migliori rese di reazione, consumo ridotto di reagenti e adattabilità per l’automazione (Goyal et al., Sens. & Atto. B, 2014; Hairong et al., LOC, 2014; Hairong et al., Bioconj. Chimica., 2014; Zeng et al., Nuc. Med. & Bio., 2013; Wheeler et al., LOC, 2010). Attualmente, stiamo ottimizzando ulteriormente i microreattori e sviluppando un sistema integrato per uso clinico e di ricerca. Questo progetto è in collaborazione con il Prof. Il gruppo di ricerca di David Reichert presso il dipartimento di Chimica radiologica della Washington University, St. Louis.

4b. Microreattori per la sintesi di punti quantici:

Le nanoparticelle fluorescenti a semiconduttore mostrano promesse nell’illuminazione a stato solido e nella tecnologia di visualizzazione a causa della fotoluminescenza significativamente più elevata e del migliore comportamento spettrale rispetto alla tecnologia convenzionale del fosforo. Queste nanoparticelle hanno anche potenziali usi nell’imaging medico e nell’informatica quantistica. Elevati costi di produzione dovuti in parte alla mancanza di metodi affidabili per la produzione di alta qualità, le nanoparticelle monodisperse attualmente inibiscono notevolmente il loro uso diffuso. I metodi di sintesi batch convenzionali risentono soprattutto della variazione della qualità dei nanomateriali da lotto a lotto. Le sintesi batch, a causa del lento trasferimento di calore e massa, non hanno la capacità di controllare con precisione le dimensioni, la morfologia e la composizione delle nanoparticelle. I reattori a flusso continuo forniscono una potenziale soluzione a questi problemi. Gli sforzi in Kenis group sono focalizzati sullo sviluppo di reattori continui ad alta produttività che offrono tempi di miscelazione e riscaldamento rapidi a temperature elevate per sintetizzare nanoparticelle di semiconduttori di alta qualità di diversa composizione e morfologia. Ad esempio, abbiamo sintetizzato con successo nanorod utilizzando uno dei nostri reattori a flusso continuo (vedi figura). Stiamo studiando sia sistemi contenenti Cd che Cd-free, raggiungendo rendimenti quantistici fino al 60%, che è paragonabile ai prodotti commerciali.

(5) Tecnologie di produzione per microfluidica

Nel nostro gruppo di ricerca, esploriamo varie tecnologie di produzione per far progredire lo sviluppo di dispositivi microfluidici. L’obiettivo in questo settore è quello di facilitare l’integrazione della microfluidica con le applicazioni finali. Attualmente, stiamo perseguendo la ricerca in due direzioni:

5a. Componenti microfluidici per migliorare la portabilità e la scalabilità dei dispositivi:

L’avvento della microfluidica VLSI (very Large Scale Integration) ha permesso di eseguire applicazioni multi-step e high-throughput con operazioni massicciamente parallele su un singolo chip. Chiave di questi progressi è stato lo sviluppo di microvalvole pneumatiche, che sono fabbricati con tecniche soft-litografiche. Nonostante il successo dell’integrazione di tali microvalvole pneumatiche in chip microfluidici per diverse applicazioni, queste microvalvole richiedono accessori ingombranti, che limitano la scalabilità e la portabilità di questi chip microfluidici. Affrontiamo questi problemi in due modi:

Uso di un’architettura di valvola normalmente chiusa (NC) architettura di valvola: i dispositivi che impiegano valvole convenzionali normalmente aperte (NO) hanno una portabilità limitata in applicazioni che richiedono uno stato chiuso continuo per il funzionamento, poiché queste valvole necessitano di accessori ingombranti (pompe, bombole di gas azoto, periferiche pneumatiche) per l’azionamento. Le valvole NC non solo affrontano la suddetta limitazione della portabilità limitata, ma mantengono anche la facilità di fabbricazione e integrazione in dispositivi microfluidici. Per consentire l’integrazione delle valvole NC, abbiamo utilizzato una combinazione di modellazione analitica e computazionale e esperimenti sistematici per formulare regole di progettazione per lo sviluppo di valvole NC ottimali con l’obiettivo di ridurre al minimo le pressioni di attuazione e facilitare la fabbricazione di queste valvole (Mohan et al., Sens. & Atto. B, 2011). La figura mostra la pressione di azionamento necessaria in funzione della larghezza del canale del fluido per diverse forme di microvalvola (diritta, a forma di v e diagonale). Abbiamo utilizzato queste valvole per una varietà di applicazioni, come il rilevamento di virus delle interazioni proteina–anticorpo, la cristallizzazione delle proteine, lo screening delle forme solide e l’esplorazione di altre applicazioni (Schudel et al., LOC, 2011; Thorson et al., CrystEngComm, 2012; Guha et al., Sens, & Atto. B, 2012; Mohan et al., Bioseni. & Bioelect., 2013; Tice et al., JMEMS, 2013).

Uso di microvalvole elettrostatiche per sostituire o integrare le microvalvole pneumatiche: Le nostre microvalvole basate sull’azionamento elettrostatico mantengono l’ingombro ridotto (1), per spessori di membrana ™ di 5 µm. Lo spazio dei parametri di progettazione è stimato per la presenza di aria (più scura), olio (tratteggiato) o acqua (più chiara) nel canale fluidico. Un’altra applicazione interessante che stiamo esplorando è l’uso di microvalvole elettrostatiche per controllare le microvalvole pneumatiche. Questa combinazione di microvalvole pneumatiche ed elettrostatiche semplificherà notevolmente gli accessori e aiuterà a realizzare l’obiettivo del “lab-in-a-chip” piuttosto che del “chip-in-a-lab”.

5 ter. Nuovi materiali e processi di fabbricazione:

Il poli (dimetilsilossano) o PDMS è stato il materiale preferito per la fabbricazione di dispositivi microfluidici, principalmente perché l’uso di PDMS consente una fabbricazione semplice, rapida e poco costosa di dispositivi con vari gradi di complessità. Tuttavia, il PDMS soffre di diverse limitazioni, una delle quali è l’incompatibilità con un’ampia gamma di solventi organici e tecniche analitiche. Nel nostro gruppo di ricerca, stiamo esplorando una varietà di materiali polimerici come alternativa al PDMS per la produzione di dispositivi microfluidici; alcuni di questi materiali sono tiolene, ciclico-olefina copolimero e Teflon. Abbiamo utilizzato questi materiali per sviluppare dispositivi microfluidici compatibili con una gamma di solventi organici e tecniche analitiche, come i raggi X e il Raman. Mostriamo anche che i dispositivi ibridi, che combinano i vantaggi di materiali diversi, sono alternative superiori ai dispositivi che comprendono uno o due materiali.

(6) Progetti ” bio ” microfluidici emergenti

6a. Piattaforme microfluidiche per spettroscopia FTIR a risoluzione temporale:

Il nostro obiettivo generale è quello di sviluppare una tecnologia microfluidica innovativa per la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier risolta nel tempo (FT-IR) di reazioni o interazioni biomolecolari. Il folding proteico, la catalisi enzimatica e le interazioni proteina-ligando sono fondamentali per mantenere cellule e tessuti sani. La radice di molte malattie croniche o genetiche può essere fatta risalire al malfunzionamento di tali reazioni nelle proteine – ad esempio, la formazione di placca da peptide beta-amiloide misfolded nella malattia di Alzheimer.

Le indagini per rivelare i meccanismi di reazione a livello molecolare e intermolecolare sono essenziali per lo sviluppo di nuove terapie dalla progettazione razionale dei farmaci e ai loro test – ad esempio, i percorsi di piegatura beta-amiloide possono rivelare obiettivi su cui i farmaci candidati contro la formazione di placche possono essere testati e ottimizzati. La spettroscopia a infrarossi a trasformata di Fourier (FTIR) offre diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche di spettroscopia, tra cui il non requisito dell’etichettatura estrinseca, la semplice preparazione del campione e la facile acquisizione di una serie di informazioni (dettagli molecolari ad alta risoluzione alle interazioni proteina-proteina a bassa risoluzione).

Tuttavia, diverse limitazioni con le attuali celle di flusso FTIR, tra cui bassa risoluzione temporale, costi e requisiti di grandi volumi di campioni, hanno impedito l’uso diffuso di FTIR. Affrontiamo questi problemi sviluppando celle di flusso FITR microfluidiche con materiali trasparenti a basso costo. I risultati preliminari con ubiquitina hanno convalidato il nostro approccio e stiamo ottimizzando la cella di flusso per condurre esperimenti con proteine clinicamente rilevanti. Questo progetto è in collaborazione con il Prof. Rohit Bhargava del Dipartimento di Bioingegneria.

6b. Tecnologie microfluidiche per migliorare il processo di trapianto di isole:

Il diabete è una malattia devastante che colpisce 25,8 milioni di americani (8% della popolazione). Il trapianto di isole umane è una terapia promettente per il diabete mellito di tipo I (TIDM). Questa procedura, tuttavia, non è molto riproducibile e coerente. Per migliorare i risultati del trapianto di isole, è necessario affrontare diversi problemi clinici, biologici e ingegneristici. Nel nostro gruppo di ricerca, stiamo sviluppando tecnologie microfluidiche per affrontare alcuni di questi problemi, tra cui il mantenimento di condizioni ottimali durante l’isolamento delle isole dal pancreas donatore, l’automazione del processo di isolamento e separazione delle isole e la conservazione della vitalità e della funzionalità dell’isoletta durante il processo di trapianto. Questo progetto è in collaborazione con il gruppo di ricerca del Prof. Jose Oberholzer nella Divisione di Chirurgia dei trapianti presso l’Università dell’Illinois a Chicago.

6c. Piattaforma microfluidica per studi EPR freeze-quench:

La maggior parte dei fenomeni interessanti in molte reazioni biochimiche si verificano durante i primi millisecondi delle reazioni, ad esempio, sintesi di ATP mediata dal complesso del citocromo bc1. Gli studi strutturali e funzionali di questi prodotti intermedi in fase iniziale non solo chiariranno il meccanismo di queste reazioni, ma consentiranno anche la progettazione razionale di farmaci per il trattamento di malattie e disturbi associati al malfunzionamento di queste reazioni. La risonanza paramagnetica elettronica freeze-quench (EPR) è una tecnica potente per studiare queste reazioni, in cui i prodotti intermedi di queste reazioni vengono rapidamente congelati per prevenire ulteriori reazioni e successivamente analizzati utilizzando EPR. Tuttavia, le limitazioni dell’apparato corrente per l’EPR di congelamento-estinzione, principalmente la lenta miscelazione dei reagenti, hanno impedito l’applicazione di questa tecnica per studiare reazioni biochimiche ultraveloci. Nel nostro gruppo di ricerca, stiamo sviluppando un dispositivo microfluidico per la miscelazione rapida dei reagenti (~20 µs) e la successiva espulsione dei reagenti misti sotto forma di un getto ultrasottile su una ruota di rame congelata. Abbiamo convalidato questo approccio con un modello di reazione biochimica e stiamo esplorando l’applicazione di reazioni biochimiche clinicamente rilevanti. Questo progetto è in collaborazione con il Prof. Tony Crofts del Dipartimento di Biochimica.

6d. Determinazione delle interazioni farmaco-bersaglio:

Tutta la biologia, e per estensione tutta la farmacologia, dipende dall’interazione delle proteine con altre molecole. La risonanza paramagnetica elettronica (EPR) combinata con l’etichettatura di Spin (SLEPR) può essere utilizzata per rilevare tali interazioni in tempo reale, in vitro o in vivo, e per tracciare il rapporto tra proteine legate e non legate, con una perturbazione minima della biologia. Questo lo rende uno strumento ideale per studiare direttamente gli effetti degli agenti farmaceutici sul loro bersaglio biologico e sui relativi sistemi biochimici, migliorando l’accuratezza delle previsioni di sviluppo in fase iniziale di efficacia e tossicità dei candidati ai farmaci. Tuttavia, gli attuali metodi wet-lab per la preparazione dei piccoli campioni richiesti dagli spettrometri EPR tendono ad essere dispendiosi, imprecisi e lenti (impiegando 24 ore o più). Nel nostro gruppo stiamo sviluppando dispositivi per l’etichettatura rapida e precisa delle proteine, sfruttando appieno la natura combinatoria dei chip microfluidici per creare una serie di campioni a concentrazioni multiple o con una varietà di partner e incorporando colture cellulari su chip quando necessario. Questo progetto è in collaborazione con New Liberty Proteomics.