C. Poliacrilammide Embedded with Fluorescent Beads
Come descritto nella sezione precedente, i substrati di silicio si sono dimostrati preziosi per misurare le forze esercitate dai cheratociti in rapido movimento. Tuttavia, questi stessi substrati sono molto meno utili per studiare la maggior parte delle cellule di mammifero. Per trazioni da calcolare con precisione, il substrato deve essere sintonizzato per abbinare la motilità e la generazione di forza di un dato tipo di cella. È difficile produrre con precisione un substrato di silicio di conformità desiderata per le cellule in movimento più lento in grado di esercitare forze superiori. Per superare questa limitazione, Dembo e Wang (1999) hanno utilizzato un substrato di poliacrilammide incorporato con perline fluorescenti di dimensioni submicrometriche. La conformità del substrato di poliacrilammide può essere sintonizzata chimicamente variando le concentrazioni di monomero e reticolato (Pelham e Wang, 1997). La poliacrilammide offre diversi vantaggi aggiuntivi rispetto ai substrati di silicio. Su una vasta gamma di deformazioni, presenta un comportamento linearmente elastico. Inoltre, la poliacrilammide non è tipicamente suscettibile di legame cellulare da sola, senza la coniugazione di specifici ligandi di adesione cellulare (Nelson et al., 2003). Pertanto, è un’impalcatura perfetta per studiare l’adesione e il comportamento cellulare in modo controllabile e definito.
Il metodo computazionale con cui vengono utilizzate deformazioni nel substrato per determinare le trazioni esercitate dalla cella è molto simile ai metodi utilizzati sui suddetti substrati di silicio sollecitato. Tuttavia, l’utilizzo di marcatori fluorescenti ha notevolmente migliorato il metodo di tracciamento e la capacità di calcolare un campo di deformazione accurato.
Dembo e Wang hanno pubblicato diversi studi utilizzando la tecnica risultante, la microscopia a forza di trazione, che chiariscono i meccanismi della migrazione dei fibroblasti. In particolare, hanno dimostrato che la lamellipodia della cellula fornisce quasi tutta la forza necessaria per la locomozione in avanti (Munevar et al., 2001a). I loro risultati indicano che il lamellipodio è un’entità meccanica distinta dal resto del corpo cellulare. È interessante notare che questa stessa divisione meccanica all’interno della cellula non sembra esistere nelle cellule trasformate da H-ras, forse spiegando la differenza nel loro comportamento mobile. Inoltre, Beningo et al. (2001) ha studiato il ruolo delle aderenze focali nella regolazione della generazione di trazione e ha scoperto che la dimensione delle aderenze focali è inversamente correlata alla quantità di forza generata. Inoltre, la distribuzione delle aderenze non corrisponde bene con la distribuzione delle forze di trazione. Gli autori concludono che questi risultati possono indicare che i primi complessi focali sono responsabili di forti forze propulsive, e la maturazione di questi siti di adesione si traduce in un cambiamento in siti di ancoraggio passivi — una conclusione che è stata ampiamente discussa in letteratura. Inoltre, Dembo e colleghi hanno studiato i ruoli dinamici che le aderenze anteriore-contro-posteriore (Munevar et al., 2001b), miosina IIb (Lo et al., 2004), chinasi di adesione focale (Wang et al., 2001) e i canali Ca2 + attivati dall’allungamento giocano nella migrazione dei fibroblasti (Munevar et al., 2004). Utilizzando la microscopia a forza di trazione, Dembo e colleghi hanno compiuto progressi significativi nella comprensione del ruolo della generazione di forza nella migrazione dei fibroblasti.
Uno dei progressi tecnici più significativi che utilizzano il gel di poliacrilammide è la capacità di controllare in modo affidabile la conformità del substrato cellulare senza modificare la densità ECM. La messa a punto della conformità del substrato è stata un punto di svolta critico nello sviluppo della microscopia a forza di trazione, in quanto ha permesso l’indagine di quasi tutti i tipi di cellule e una comprensione del comportamento cellulare in funzione dell’ambiente meccanico. Prima dello studio di Pelham e Wang (1997), la maggior parte degli studi che studiavano la migrazione e l’adesione cellulare si concentravano sulla migrazione cellulare in risposta al suo ambiente chimico solubile (chemiotassi) o in risposta al ligando coniugato al substrato (aptotassi). Inoltre, gli studi che coinvolgono l’ambiente meccanico della cellula si sono concentrati sulla risposta dovuta a forze imposte come lo stress da taglio fluido e l’allungamento meccanico. Tuttavia, cambiando la rigidità del substrato, Pelham e Wang (1997) hanno creato un cambiamento significativo nel modo in cui i ricercatori si avvicinano alla risposta cellulare e alla meccanotrasduzione. Utilizzando substrati di poliacrilammide, Pelham e Wang hanno mantenuto costante la densità ECM sul substrato alterando la conformità meccanica. Hanno dimostrato che i fibroblasti sono in grado di rispondere attivamente alla conformità meccanica del loro substrato. Le cellule su gel più rigidi sono più diffuse e migrano più lentamente rispetto alle cellule su gel più conformi. Inoltre, la capacità delle cellule di percepire la conformità meccanica del loro substrato si riflette nella loro capacità di modificare lo stato di fosforilazione di numerose proteine contenute all’interno della struttura di adesione focale. Le adesioni focali su substrati rigidi sono più grandi, più allungate e più stabili, mentre le adesioni focali su substrati più conformi contengono meno PP125FAK e paxillin fosforilati e appaiono molto più irregolarmente. Questi risultati sono stati i primi a suggerire che i segnali ECM meccanici possono essere altrettanto importanti dei segnali chimici nella regolazione dell’adesione cellulare.
Dall’articolo seminale di Pelham e Wang (1997), una serie di studi ha studiato gli effetti della conformità sul comportamento cellulare. Lo et al. (2000) ha usato la chimica della poliacrilammide per creare un substrato contenente un passo nella rigidità — una regione centrale del substrato in cui si incontrano due substrati di diverse conformità. Hanno dimostrato un comportamento chiamato durotassi, con il quale le cellule sono state in grado di rilevare attivamente e rispondere ai cambiamenti nella conformità del substrato. Le cellule che migravano sul substrato morbido, colpendo il confine della transizione rigido–morbido, si incrociavano sul substrato rigido, mentre le cellule su substrati rigidi mostravano trazioni più elevate e un’area di diffusione maggiore, e ritrattavano o cambiavano direzione in risposta al confine rigido–morbido. Più tardi, Wong et al. (2003) ha studiato la capacità dei fibroblasti di migrare su idrogel di poliacrilammide contenenti gradienti di conformità, piuttosto che un passo, come è stato fatto da Lo e colleghi. Hanno scoperto che le cellule muscolari lisce vascolari tendono a migrare più velocemente su substrati più morbidi rispetto a substrati più rigidi (15 kPa vs 25 kPa) e che le cellule tendono ad accumularsi su substrati più rigidi. Inoltre, il modello di migrazione su gel conformi al gradiente sembrava essere diretto verso le regioni gel più rigide piuttosto che esibire il tipico modello di camminata casuale caratteristico della migrazione cellulare. Engler et al. (2004) ha ulteriormente studiato la risposta cellulare ai gel conformi e ha dimostrato che la risposta è in gran parte mediata dall’assemblaggio del citoscheletro di actina. Testando i cambiamenti nel citoscheletro, Engler e colleghi sono stati in grado di dimostrare che una leggera sovraespressione di actina nella cellula può compensare la perdita di diffusione osservata nelle risposte di gel morbido. Inoltre, Yeung et al. (2005) ha dimostrato che la soglia di sensibilità per il rilevamento della conformità è specifica del tipo cellulare e che i contatti cellula–cellula possono anche aiutare a salvare i cambiamenti morfologici osservati nei substrati morbidi per assomigliare più strettamente alla morfologia delle cellule su substrati più rigidi (Yeung et al., 2005). Nel complesso, lo studio della durotassi è ancora relativamente giovane e rimane molto da imparare su come una cellula percepisce e risponde meccanicamente alle proprietà del materiale del suo substrato e dell’ambiente.
