2.3.4.1 La struttura
L’omodimero apo-sCTLA-4 è stato espresso come proteina di fusione Fc clivabile dalla trombina nelle cellule CHO in presenza di kifunensine.23 Dopo la deglicosilazione, l’omodimero ha prodotto cristalli diffrattanti a spaziature di Bragg di 1,8 Å, con dimensioni delle celle unitarie di a = 43,86 Å, b = 51,46 Å e c = 102,85 Å e il gruppo spaziale P212121 (Rif. 130). La struttura è stata risolta mediante sostituzione molecolare. L’unità asimmetrica comprendeva un omodimero legato al disolfuro che consentiva confronti con i complessi sCTLA-4/sB7-1 e sCTLA-4/sB7-2 e con sCTLA-4 legato a una lipocalina ingegnerizzata.131
I due monomeri nell’unità asimmetrica erano composti da domini β-sandwich con topologia AGFCC’ e ABED come anticipato da Metzler et al.132 Un breve “gambo” di otto residui legato al disolfuro a Cys122 collegava i domini IgSF alla membrana. Inaspettatamente, le due metà dell’omodimero apo-CTLA-4 erano meno simili tra loro rispetto alle loro controparti complessate, sottolineando che il legame non è accompagnato da riarrangiamenti strutturali su larga scala (Fig. 2.2 H). I confronti automatizzati delle strutture hanno identificato CD28 e PD-1 come le strutture più simili a CTLA-4. Differenze importanti tra CTLA-4 e CD28 erano: (i) la presenza di un nodo in β-filamento G di CD28, (ii) cambiamenti in loop-size tra cui esteso AB, BC, e CC’ loop in CTLA-4 e un troncato C”D loop, e (iii) H-bonding dei C’ e C” β-trefoli derivanti dal riposizionamento del ciclo C” C ” in CD28. Di fondamentale importanza è stata la conformazione in gran parte identica della sequenza FG loop 99MYPPPY104 che forma il nucleo delle loro superfici leganti il legante. Solo una singola molecola d’acqua potrebbe essere trovata nella superficie legante ligando insolitamente secca di apo-CTLA-4, mentre 228 acque sono state rilevate altrove.
Dopo CD28 e PD-1, le strutture successive più simili al dominio V-set CTLA-4 erano 215 domini V anticorpali o TCR, che differivano principalmente solo per le lunghezze del loop. La differenza r. m. s. per la sovrapposizione di CTLA-4 con il dominio TCR Va più simile era di 2,09 Å per 102 residui, in contrasto con 2,89 Å per 86 residui per la sovrapposizione con d1 di CD2. Importanti caratteristiche condivise con il dominio Va includevano il lungo ciclo CC ‘e conservavano i rigonfiamenti β nei filamenti β C’ e G che imponevano una torsione pronunciata sul foglio β AGFCC’. Particolarmente degno di nota è stato l’alto grado di conservazione della sequenza e la conformazione Ca vicino al filamento G β-rigonfiamento, cioè GNGTQIYV (CTLA-4) e GDGTQLVV (Va). In CD2 e CTLA-4, i loop erano simili e i domini differivano in quanto: (i) nel CD2 non c’era H-bonding del ßA e ßB fili, (ii) non vi è stata alcuna torsione di UN’GFCC’ β-foglio CD2 causa di riposizionamento della β-rigonfiamenti, (iii) la posizione della C” β-strand nel CD2, ma non CTLA-4 ammessi canonica H-bonding e l’estensione del AGFCC’C” β-foglio, e (iv) CTLA-4 mancava la torsione del FG loop presenti nel CD2 (e anche, ad esempio, B7-1). L’analisi di cinquantadue domini IgSF V-set utilizzando un programma di allineamento sequenziale della struttura133 ha indicato che la famiglia CD28 / CTLA-4 comprende un sottogruppo di domini V-set distinti dai raggruppamenti di CD8, recettori dell’antigene e molecole di “adesione”, ad esempio B7-1 e CD2. Nel complesso, c’era una maggiore somiglianza del sottogruppo CD28/CTLA-4 alla famiglia dei recettori dell’antigene, rispetto al set di adesione. L’analisi ha suggerito che le proteine della famiglia CD28/CTLA-4 e i recettori dell’antigene condividevano un antenato comune probabilmente simile a PD-1, con le due famiglie divergenti precocemente.
Apo-CTLA-4 comprendeva un omodimero con le sue subunità che adottavano una disposizione che favoriva le interazioni bivalenti ortogonali con ligandi posizionati sulle superfici cellulari apposte. I confronti con le coppie di monomeri CTLA-4 nei complessi B7-1 e B7-2106,107 e il monomero nel complesso lipocalin131 hanno rivelato una flessibilità rotazionale molto limitata all’interfaccia dell’omodimero e notevolmente pochi, se del caso, cambiamenti attribuibili al legame del ligando. Le uniche differenze erano evidenti nel complesso B7-2, con leggero riposizionamento dei cicli BC e CC’, e del C” β-strand e cicli vicini, e differenze conformazionali nel G β-strand al suo C-terminale. Queste variazioni locali erano distanti dal sito legante di CTLA-4 e per nessun caso i monomeri apo differivano sistematicamente da tutti e cinque i monomeri CTLA-4 complessi. Le posizioni dell’atomo della catena principale della sequenza 99MYPPPY104 erano essenzialmente identiche.
Le strutture dei complessi formati da CTLA-4 con B7-1 e B7-2, che non erano stati precedentemente confrontati, erano molto diverse.130 Sostituzione in B7-2, di Val28 vs Arg29 in B7-1, formato una tasca vincolante in B7-2 che è stato riempito solo in parte da CTLA-4. Ciò ha assicurato che il complesso B7-1/CTLA-4 mostrasse una migliore complementarità di forma rispetto al complesso B7-2 / CTLA-4. Compensando leggermente per questo, la superficie sepolta in B7-2 da CTLA-4 era leggermente più grande di quella per B7-1. Nel complesso, B7-1 legato CTLA-4 in modo ancora più rigido del corpo-come CTLA-4 impegnato B7-1. B7-2 vincolante da CTLA-4 era, però, più complessa e portava il segno distintivo di “induced fit.”In CTLA-4 bound-vs apo-B7–2, c’è stato uno spostamento di 2,3-3,5 Å del ciclo B7-2 FG verso CTLA-4, che è stato avviato da una rotazione di ~ 120 gradi di Phe31 di B7-2 (Ref. 130). Ciò ha prodotto un’interazione di impilamento di Phe31 con Pro102 della sequenza 99MYPPPY104 di CTLA-4.
