MODIFICA ASPETTO
Le cellule di Klebsiella pneumoniae appaiono nell’immagine microscopica leggera come barre corte con una lunghezza di 1-2 µm e una larghezza di 0,5–0,8 µm. Sono presenti singolarmente o in coppia e sono circondati da una capsula mucosa (glicocalice). Nella colorazione Gram, sono macchiati di rosa al rosso, sono gram-negativi. Come è tipico per il genere Klebsiella, non sono attivamente mobili (mobili), quindi non hanno flagelli (flagelli). Tuttavia, la superficie cellulare è occupata da fimbrie. Le colonie batteriche coltivate su un mezzo nutritivo non hanno una colorazione speciale, sono convesse sollevate, rotonde nella vista dall’alto e piuttosto grandi con un diametro di 3-4 mm, il loro aspetto viscido è tipico. Ciò è causato dall’accumulo di polisaccaridi extracellulari, che insieme all’acqua presente formano un biofilm.
Crescita e METABOLISMO
Come al solito per i rappresentanti delle Enterobacteriaceae, il test della catalasi è positivo e il test dell’ossidasi è negativo. Klebsiella pneumoniae è facoltativamente anaerobica, cioè può crescere con o senza ossigeno. È in grado di utilizzare il lattosio disaccaride. Ulteriori informazioni possono essere trovate nella sezione Prove biochimiche.
Inoltre, è uno dei microrganismi che fissano l’azoto, può ridurre l’azoto molecolare elementare (N2) in ammoniaca (NH3) o ammonio (NH4+) e quindi renderlo biologicamente disponibile. Questo viene fatto con l’aiuto del complesso enzimatico nitrogenasi in un ambiente anossico, poiché il complesso enzimatico è inattivato dall’ossigeno. Klebsiella pneumoniae è diazotropica, quindi può crescere con N2 come fonte di azoto per costruire sostanze specifiche delle cellule come gli amminoacidi.
I terreni nutritivi semplici sono adatti per la coltivazione, ad esempio l’agar caseina-soia-peptone (CASO agar), i batteri possono anche essere coltivati su Columbia blood agar. Spesso vengono utilizzati mezzi nutritivi selettivi adatti per isolare e distinguere i rappresentanti degli enterobatteri, ad esempio l’agar MacConkey e l’agar eosina-metilene-blu (EMB), entrambi contenenti lattosio. Per un’ulteriore selezione, si raccomanda un mezzo nutritivo, che come fonte di carbonio (composto organico per la produzione di energia) contiene solo citrato e inositolo, si basa sull’agar citrato di Simmons con l’aggiunta di 1% di inositolo. Klebsiella pneumoniae è mesofila, la crescita ottimale avviene a una temperatura di 30-37 °C, le colonie sono visibili dopo l’incubazione per uno o due giorni. La crescita avviene anche a 41 ° C, ma non a 5 ° C. I ceppi batterici isolati dal materiale della visita medica di solito crescono in modo ottimale a 37 ° C., tuttavia, varie reazioni di rilevamento per l’identificazione procedono meglio ad una temperatura di incubazione di 30 ° C.
Chemiotassonomia
I componenti della cellula batterica agiscono come antigeni, in Klebsiella questi sono 77 diversi antigeni K (K si riferisce alla capsula), così come 9 antigeni O somatici. Di importanza diagnostica sono gli antigeni K, mediante esame sierologico si possono distinguere i diversi sierotipi, che, tra le altre cose. viene utilizzato nella delucidazione delle relazioni epidemiologiche. Tuttavia, esiste anche un metodo ELISA per la rilevazione degli antigeni O. La determinazione può anche essere effettuata con l’aiuto di studi genetici.
GENETICA
Il contenuto di GC, cioè la proporzione delle nucleobasi guanina e citosina nel DNA batterico, è del 57,0 mol per cento per il ceppo batterico DSM 30104 (dalla raccolta di ceppi DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). DSM 30104 è il ceppo tipo della sottospecie Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae e quindi anche la specie, è stato isolato dal sangue umano. Il genoma è stato completamente sequenziato nel 2012.
È presente come cromosoma batterico a forma di anello e ha una dimensione di 5.512 coppie di kilobasi (kb), che è approssimativamente paragonabile alla dimensione del genoma di Escherichia coli. Ci sono 5.425 geni codificanti presenti, inoltre, sono stati identificati 77 TRNA. I geni sono stati confrontati con il database dei geni di resistenza agli antibiotici (ARDB, Database dei geni di resistenza agli antibiotici), è stato possibile identificare i geni 15 che mediano la resistenza, u. a. per una beta-lattamasi di classe A e una pompa di efflusso. Dieci altri geni codificano per prodotti genici che estendono le capacità β-lattamasi del batterio, incluso il gene chiamato ampC, che codifica per l’enzima chiamato AmpC-beta-lattamasi (in questo caso una cefalosporinasi) e il gene chiamato gloB, che codifica per un enzima chiamato metallo-β-lattamasi (in questo caso una carbapenemasi). Da allora, oltre 4 sono stati.Sono stati sequenziati 200 genomi (basati sul cromosoma batterico circolare) di questa specie e sono state eseguite anche 913 annotazioni di plasmidi (a partire dal 2018).
I plasmidi spesso portano le informazioni genetiche per la resistenza agli antibiotici (vedi sotto) del batterio, i prodotti genetici sono enzimi che cambiano una certa struttura chimica di un antibiotico e quindi impediscono l’azione del farmaco. In Klebsiella pneumoniae, queste sono beta-lattamasi codificate da plasmidi, come SHV-1, TEM-1, TEM-2 o altre ESBL (β-lattamasi a spettro esteso).Dall’inizio del 21 ° secolo, è stata osservata anche resistenza ai carbapenemi, causata da carbapenemasi (carbapenem idrolizzante beta-lattamasi), che sono indicati come KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemasi) dopo il batterio produttore, varie varianti sono chiamate KPC-1, KPC-2 o KPC-3. La particolarità dei plasmidi è che vengono scambiati tra diversi tipi di batteri mediante trasferimento genico orizzontale, e quindi la resistenza agli antibiotici viene “trasferita”. Un caso clinico del trasferimento di un plasmide con il gene di resistenza blaKPC-3 da K. pneumoniae a K. aerogenes è descritto nell’articolo.
Lo studio della sequenza nucleotidica dei singoli geni ha mostrato che la specie Klebsiella pneumoniae ha una grande diversità. Ulteriori indagini genetiche, ad esempio una modifica del metodo PCR con DNA polimorfico duplicato casualmente (RAPD), confermano il verificarsi di tre diversi gruppi filogenetici, che sono indicati come KpI, KpII e KpIII. Non sono identici alle tre sottospecie. Ulteriori indagini genetiche negli ultimi anni, come il sequenziamento dell’RNA ribosomiale 16S (rRNA) e l’analisi della sequenza multi-locus (MLSA) di alcuni geni hanno portato alla classificazione dei rappresentanti del gruppo KpII come Klebsiella quasipneumoniae e dei ceppi del gruppo filogenetico KpIII come Klebsiella variicola.
Patogenicità Modifica
Le tre sottospecie di K. i pneumoniae sono assegnati al gruppo di rischio 2 dal Biosoffverordnung in combinazione con il TRBA (Regole tecniche per gli agenti biologici) 466. In K. pneumoniae subsp. pneumoniae e K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis contiene anche l’osservazione ht, indica che il batterio è patogeno per l’uomo e i vertebrati, ma, di regola, non vi è alcuna trasmissione tra entrambi i gruppi ospiti.
K. pneumoniae ha diversi fattori di virulenza. La capsula (glicocalice) protegge dalla fagocitosi da parte dei fagociti, cellule del sistema immunitario. Interferisce con il sistema del complemento coinvolto nella difesa contro i microrganismi impedendo la sua attivazione o l’assorbimento di polipeptidi già rilasciati, come C3b. Le adesine consentono di attaccarsi alle cellule ospiti. Alcune adesine di K. pneumoniae agiscono simultaneamente come emoagglutinine e sono assegnate alle fimbrie (pili). Le fimbrie di tipo 1 portano ad un’agglutinazione visibile negli eritrociti delle cavie, si attaccano alle cellule epiteliali umane dell’intestino o alle cellule epiteliali del tratto urinario. K. gli isolati di pneumoniae da campioni medici formano più fimbrie di tipo 1 rispetto agli isolati da campioni ambientali. Si verificano anche fimbrie di tipo 3, mediano l’attaccamento dei batteri al sistema radicale della pianta, così come nell’uomo alle cellule endoteliali, alle cellule epiteliali degli alveoli polmonari e delle vie urinarie e al collagene di tipo V. Il ruolo delle fimbrie di tipo 3 nell’infezione degli esseri umani è ancora oggetto di ricerca. Si ritiene che siano responsabili della colonizzazione di dispositivi medici invasivi che rimangono nel corpo per lungo tempo.
I lipopolisaccaridi (LPS) della membrana esterna agiscono come antigeni, le catene polisaccaridiche dirette verso l’esterno sono chiamate antigeni O (confronta lo schema Kauffmann-White usato per la salmonella). K. pneumoniae possiede nove diversi antigeni O, con O1 che è il più abbondante. Gli antigeni O interferiscono anche con la cascata di reazione del sistema del complemento. Inoltre, O1 è coinvolto nella necrosi del tessuto infetto. I siderofori batterici sono anche importanti per la patogenicità. Servono a fornire alle cellule ioni di ferro essenziali per il metabolismo legando ioni Fe3+. K. pneumoniae forma enterobactin (enterochelin), mentre solo alcuni ceppi producono inoltre aerobactin. Nei sierotipi K1 e K2, è stato trovato un plasmide su cui è codificata l’informazione genetica per l’idrossammato aerobactin. Se questi geni vengono trasferiti a un ceppo senza plasmide con l’aiuto della trasformazione, le cellule trasformate hanno una maggiore virulenza di un fattore 100. Inoltre, yersiniabactin, un sideroforo tipico delle specie di Yersinia, è formato da alcuni ceppi.
Rilevamenti biochimici
K. pneumoniae è strettamente correlato a K. aerogenes (precedentemente collocato nel genere Enterobacter) e Enterobacter cloacae. I batteri mostrano una spiccata versatilità in termini di utilizzo di vari carboidrati e, con poche eccezioni, hanno le stesse caratteristiche biochimiche, come gli enzimi presenti e le conseguenti proprietà metaboliche.
Rappresentanti del genere Klebsiella effettuano la fermentazione 2,3-butandiolo per la produzione di energia come fermentazione tipica, l’acetoina, un prodotto intermedio della fermentazione 2,3-butandiolo, viene rilevato nel test Voges-Proskauer. I rappresentanti dei generi correlati Enterobacter e Klebsiella reagiscono positivamente qui. In linea di principio, questo vale anche per K. pneumoniae, ma le sottospecie o i singoli ceppi batterici mostrano reazioni diverse, cioè anche un risultato negativo nel test VP. Il tipo di ceppo DSM 30104, in contrasto con la descrizione della specie, è VP-negativo (cioè, non produce acetoina dal piruvato), ma mostra un risultato positivo nel test rosso metile, che è tipico per i rappresentanti della fermentazione acida mista. Queste differenze nel fenotipo fisiologico riflettono la diversità genetica delle specie di batteri. Anche altre caratteristiche biochimiche non sono chiaramente definite all’interno della specie. Pertanto, il test dell’indolo è fondamentalmente adatto come caratteristica distintiva tra K. pneumoniae (indolo negativo) e Klebsiella oxytoca (indolo positivo), ma ci sono anche alcuni ceppi indolo-positivi di K. pneumoniae.
Ulteriori lavori di rilevamento
Invece di rilevare il batterio, uno è spesso limitato alla determinazione del sierotipo o alla rilevazione di singoli fattori di virulenza o geni di resistenza. Gli antigeni K e O possono essere determinati sia” convenzionalmente ” sierologicamente (indicati come sierotipizzazione nella letteratura in lingua inglese) sia, poiché la diffusione di metodi biologici molecolari, anche da questi, ad esempio con l’aiuto dell’analisi della sequenza multi-locus (MLSA). In confronto con i numerosi genomi sequenziati della specie, è stato possibile dimostrare che il sierotipo O1 si verifica quasi sempre in ceppi con gli antigeni della capsula K1 o K2. I sierotipi K1 e K2 sono considerati ipervirulenti. Gli antigeni della capsula possono anche essere determinati mediante PCR multiplex (viene rilevata più di una sezione del genoma) e elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE).
L’identificazione con il metodo MALDI-TOF in combinazione con la spettrometria di massa (MS) è fondamentalmente adatta per rilevare Klebsiella, ma non è sempre affidabile in termini di distinzione di generi strettamente correlati, ad esempio a Raoultella. Gli spettri di molte specie Gram-negative appartenenti agli enterobatteri mostrano un grande accordo (a partire dal 2013), il che rende difficile l’identificazione. Un altro studio sistematico di batteri coltivati in una soluzione nutritiva liquida contenente sangue ha dimostrato che, in particolare, i batteri con una capsula non sono identificati correttamente. D’altra parte, quando si rileva la resistenza agli antibiotici, MALDI-TOF può essere utilizzato per rilevare l’assenza o la presenza ridotta di proteine nella membrana esterna (inglese: outer membrane proteins, OMP). Di K. pneumoniae, Omk36 è importante qui, un’importante porina di membrana attraverso la quale gli antibiotici β-lattamici entrano nella cellula. Nei ceppi resistenti, è assente o si forma in piccoli numeri.
