Kluyveromyces marxianus sviluppo di etanolo di tolleranza durante l'evoluzione adattiva con i miglioramenti significativi di percorsi multipli | Biotecnologie per la produzione di Biocarburanti

Migliorata resistenza all’etanolo, dopo 100 giorni di evoluzione
L’analisi del DNA suggerisce che K. marxianus non ha alcun cambiamento di ploidy o geni critici durante l’evoluzione adattiva
Un ricablaggio globale indotto dall’evoluzione di 100 giorni
KM-100d enhanced ethanol usage
KM-100d enhanced membrane lipid biosintesi, pressione anti-osmotica, stress anti-ossidativo e ripiegamento delle proteine per resistere allo stress etanolo
Validazione del consumo di etanolo potenziato e della resistenza alle sollecitazioni multiple in KM-100d

Migliorata resistenza all’etanolo, dopo 100 giorni di evoluzione

wild-type aploide K. marxianus ceppo è stato colto in media del 6% (v/v) di etanolo a 30 °C per 100 giorni circa 450 generazioni (vedere Metodi per i dettagli). C’è stato un continuo aumento della biomassa (misurata con OD600 al giorno)durante questo periodo (Fig. 1a), indicando che la sopravvivenza cellulare sotto stress da etanolo può essere migliorata. Alla fine, abbiamo ottenuto una popolazione di K. marxianus con una resistenza notevolmente migliorata all’etanolo (Fig. 1 ter). In tutto, KM si riferisce al ceppo grezzo prima dell’evoluzione e KM-100d si riferisce alla popolazione di K. marxianus dopo l’evoluzione di 100 giorni. La resilienza massima dell’etanolo per KM era del 7% (v/v) e per KM-100d era fino al 10% (Fig. 1 ter). Abbiamo confrontato i profili di crescita tra KM e KM-100d nei terreni di coltura con diversi livelli di etanolo(0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v / v, Fig. 1c). In assenza di etanolo, non vi era alcuna differenza significativa tra i ceppi. La loro differenza è aumentata con l’aumento del livello di etanolo e ha raggiunto il massimo con 6% (v/v) di etanolo nei terreni di coltura. In tale circostanza, dopo 48 h, la biomassa di KM-100d era quasi due volte superiore a quella di KM. Entrambi i ceppi hanno mostrato una crescita ritardata nel mezzo con etanolo al 7% e non sono riusciti a crescere nel mezzo con etanolo all ‘ 8%. Inoltre, KM-100d ha anche mostrato un notevole tasso di crescita massimo superiore a KM al 6% di etanolo (File aggiuntivo 1: Figura S1).

L’analisi del DNA suggerisce che K. marxianus non ha alcun cambiamento di ploidy o geni critici durante l’evoluzione adattiva

Per chiarire le alterazioni del DNA in KM-100d, abbiamo condotto l’analisi del DNA ploidy e l’identificazione della mutazione del DNA. Durante l’evoluzione adattativa, il contenuto di DNA della popolazione di K. marxianus ha pochi cambiamenti (File aggiuntivo 1: Figura S2); quindi, nessun cambiamento ploidy ha avuto luogo. Con l’analisi del DNA-seq di KM e KM-100d, che sono stati entrambi mappati sul genoma di riferimento di K. marxianus DMKU 3-1042, sono stati ottenuti i siti SNP tra KM e KM-100d (file aggiuntivo 2). Tra i 57 SNP identificati, solo 4 siti erano dominanti nella popolazione KM-100d. Tre di loro si trovano nella regione di codifica dei geni SAN1, YAP1 e KHT2; l’altro è a 445 bp a monte di ERG26. Il sito 1324 di SAN1 è stato mutato da C a T, e di conseguenza l’aminoacido corrispondente è stato trasformato da arginina a cisteina. Tuttavia, secondo l’analisi del Pfam 32.0, questa mutazione non rientra in alcun dominio proteico identificato. Entrambe le mutazioni in YAP1 e KHT2 sono mutazioni sinonimi senza cambiamento proteico. I risultati di cui sopra suggeriscono che i cambiamenti nel contesto del DNA sono tutt’altro che sufficienti per supportare tale miglioramento del fenotipo in KM-100d, e la riprogrammazione trascrizionale deve contribuire a questo. Pertanto, abbiamo ulteriormente effettuato l’analisi RNA-seq.

Un ricablaggio globale indotto dall’evoluzione di 100 giorni

Per comprendere a fondo la tolleranza all’etanolo, abbiamo eseguito un’analisi RNA-seq per confrontare le espressioni geniche dei lieviti KM e KM-100d che sono cresciuti nei media con etanolo al 4% e al 6% (v/v). Sulla base dei profili di crescita (Fig. 1c), è stato osservato che la capacità di crescita tra KM-100d e KM aveva la differenza massima a 48 h; quindi, i campioni a 48 h sono stati raccolti per l’analisi RNA-seq. Impostazione / log2ratio / ≥ 1 e valore p < 0.05 come criterio per la definizione di geni significativi espressi in modo differenziale (DE), abbiamo eseguito l’identificazione del gene DE in sette gruppi (Fig. 2, indicato come 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7, rispettivamente). In ogni gruppo, l’analisi DE è stata effettuata in base alla freccia che punta al controllo. File aggiuntivo 3 fornisce valori di espressione e statistiche di espressione differenziale di tutti i geni. C’è una differenza di espressione globale tra KM e KM-100d quando entrambi sono cresciuti in un mezzo privo di etanolo (Fig. 2 Gruppo①). I lieviti KM-100d hanno 1342 geni con un’espressione superiore a quella del lievito KM, mentre solo 188 geni hanno un’espressione inferiore. In media con 4% e 6% (v / v) etanolo, il numero di geni up-regolati in KM-100d sono notevolmente ridotti a 415 (Gruppo②) e 453 (Gruppo③), rispettivamente. Tuttavia, i numeri di geni up-regolati sono ancora molto più di quelli con espressione inferiore (104 e 182 geni, rispettivamente). Questi risultati suggeriscono che i lieviti KM-100d sono trascrizionalmente ricablati attivando un gran numero di geni. Il suggerimento è stato ulteriormente supportato dai cambiamenti di espressione indotti dall’etanolo all’interno dei lieviti KM e KM-100d. Sotto induzione di 4% e 6% (v/v) etanolo, i lieviti KM hanno 1452 e 1465 geni up-regolati (Gruppi ⑥ e⑦) mentre i lieviti KM-100d hanno solo 631 e 596 geni up-regolati (Gruppi ④ e⑤), rispettivamente. Inoltre, abbiamo applicato heatmap.2 software nel pacchetto R per raggruppare geni e gruppi basati su valori log2ratio (file aggiuntivo 1: Figura S3) e ha trovato il profilo di espressione differenziale del gene nel gruppo ① è vicino a quello del gruppo⑦. Presi insieme, i lieviti KM-100d hanno mantenuto molte caratteristiche di espressione indotte dall’etanolo anche se sono cresciuti in un mezzo privo di etanolo. Le caratteristiche rendono la cellula evoluta più adattabile alla stimolazione dell’etanolo emergente, cioè il lievito KM-100d non deve attivare tanti geni come fa KM.

Successivamente, in ogni gruppo, abbiamo eseguito l’analisi di arricchimento dell’ontologia genica (GO) per i geni DE (file aggiuntivo 1: Figura S4), e ha scoperto che i termini GO arricchiti coprivano una vasta gamma di processi fisiologici di base cellulari, tra cui la biogenesi dei ribosomi, la biosintesi degli aminoacidi, la riparazione del DNA, l’elaborazione dell’RNA, ecc., ma non direttamente pertinente a resistenza dell’etanolo. Pertanto, nel seguito, ci siamo concentrati in particolare su percorsi fortemente associati al metabolismo e alla tolleranza dell’etanolo, analizzando i geni DE associati (file aggiuntivo 4).

KM-100d enhanced ethanol usage

Per facilitare l’illustrazione del grafico, i valori log2ratio dei geni DE coinvolti (file aggiuntivo 4) sono stati suddivisi in cinque intervalli: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (e sopra), come mostrato in Fig. 3.

È stata studiata la differenza tra KM e KM-100d nel consumo di etanolo. Come illustrato in Fig. 3, possono esistere due percorsi per il consumo diretto di etanolo ed erano entrambi regolati in KM e KM-100d di fronte all’etanolo (gruppi④,⑤, ⑥ e⑦). Un modo è tramite ADH6 citoplasmatico, che catalizza l’etanolo in acetaldeide, facilitato da NADP+. L’altro è da ATF1 mitocondriale, che promuove l’esterificazione dell’etanolo con l’aiuto di acetil-CoA. Soprattutto, in KM-100d sotto stress di etanolo (gruppi ④ e⑤), YGL039W è stato regolato per generare più NADP+ e quindi può fornire più coenzimi per convertire l’etanolo in acetaldeide per ridurre la tossicità dell’etanolo. Nei mitocondri, per KM esposti in stress di etanolo (Gruppi ⑥ e⑦), solo C2E1P301 e ADH4 erano up-regolati. Mentre in KM-100d, durante il processo dall’etanolo all’aldeide all’acetato, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 e ALD6 erano tutti regolati (Gruppo①). Le modifiche di cui sopra indicano che KM-100d potrebbe acquisire nuove capacità per alleviare la tossicità dell’etanolo aumentando il consumo di etanolo. La teoria spiega che KM-100d eseguito su KM in mezzo con etanolo.

KM-100d enhanced membrane lipid biosintesi, pressione anti-osmotica, stress anti-ossidativo e ripiegamento delle proteine per resistere allo stress etanolo

Oltre ad essere consumato, l’etanolo accumulato influenza direttamente l’integrità della membrana cellulare, altera la pressione osmotica interna ed esterna, disturba la conformazione proteica e induce la generazione reattiva delle specie di ossigeno (ROS), causando gravi danni Di seguito, abbiamo analizzato i geni DE in questi percorsi per i danni causati dall’anti-etanolo in K. marxianus (Fig. 4).

Dopo l’evoluzione guidata dall’etanolo, è stato attivato il percorso di risposta allo stress alcolico in KM-100d. ASR1, che trasloca dal citoplasma al nucleo, dopo l’esposizione all’etanolo , e ETP1, che agisce come una ritenzione citoplasmatica della proteina con un ruolo in etanolo-dipendente di attivazione trascrizionale delle proteine di scossa di calore geni , erano up-regolato in KM-media mobile a 100 giorni (Gruppo①), e in parte up-regolato in KM di fronte etanolo (Gruppi ⑥ e⑦), suggerendo anche in etanolo-libero medio, KM-100d può preparare il reattivo di percorsi per l’etanolo sfida, proprio come KM la risposta di etanolo.

La formazione di lipidi di membrana svolge un ruolo importante nel mantenere l’integrità della membrana cellulare sotto stress di etanolo . Gli acidi grassi insaturi, i componenti chiave nella struttura della membrana cellulare, sono strettamente correlati alla tolleranza all’etanolo . Illustrato in Fig. 4, dall’acetil-CoA alla biosintesi degli acidi grassi insaturi all’incorporazione in fosfolipidi, i geni coinvolti PPT2, FAD2 e TAZ1 sono stati tutti regolati in KM-100d (Gruppo①), suggerendo che dopo l’evoluzione, KM-100d potrebbe già migliorare la biosintesi degli acidi grassi insaturi per fornire più materie prime per la biogenesi della membrana cellulare. E la down-regolazione dei geni ACC1, TSC13, FAS1 in KM esposti in etanolo (Gruppi and e⑦), è in accordo con il rapporto precedente , che potrebbe spiegare la debole tolleranza all’etanolo di K. marxianus prima dell’evoluzione adattativa.

Un gran numero di geni associati alla biogenesi lipidica della membrana cellulare, inclusi fosfogliceridi, sfingolipidi e steroli, sono stati espressi in modo differenziale sotto stress da etanolo (Fig. 4). In particolare, i geni coinvolti nella biosintesi dei fosfogliceridi sono stati generalmente regolati in KM-100d (Gruppo①) e in etanolo KM-faced (Gruppi ⑥ e⑦), indicando che il fosfogliceride può essere il componente principale nella membrana cellulare per la resistenza all’etanolo. Per la biosintesi degli steroli, molti geni (ad esempio, ERG9 e ERG7) erano down-regolati nei gruppi ④ e⑥, e diversi geni erano up-regolati nel gruppo ⑤ (ad esempio, ERG25) e nel gruppo ⑦ (ad esempio, ERG26), suggerendo che la biogenesi degli steroli può essere importante per resistere all’etanolo elevato, ma non per l’etanolo basso. Inoltre, i geni CKI1, ERG2 ed ERG25, coinvolti nella biosintesi dei fosfogliceridi e degli steroli, sono stati regolati solo nel gruppo⑤; questo potrebbe essere uno degli indizi per le migliori prestazioni di KM-100d rispetto a KM in etanolo elevato.

L’alta concentrazione di etanolo in un mezzo impone uno stress osmotico sulle cellule di lievito . Come mostrato in Fig. 4, i sensori osmotici a membrana plasmatica (SLN1, OPY2 e SHO1) e i geni (HOG1, SSK1 e SSK2) coinvolti nella via reattiva a valle sono stati tutti regolati in KM esposti in basso etanolo (Gruppo⑥) e individualmente regolati in KM-100d (Gruppo①), in KM-100d di fronte all’etanolo (Gruppi ④ e⑤) e in KM di fronte La produzione di glicerolo è un modo importante per S. cerevisiae che resiste alla pressione osmotica . Quando KM e KM-100d affrontavano l’etanolo, la maggior parte dei geni legati alla biogenesi del glicerolo erano down-regolati. I risultati di cui sopra suggeriscono che prima e dopo l’evoluzione, K. marxianus migliora sempre i percorsi per il rilevamento e la trasduzione dei segnali di stress osmotici; tuttavia, la sua strategia per resistere allo stress osmotico non può fare affidamento sulla via di produzione del glicerolo, devono esistere altri modi.

La parete cellulare fornisce una resistenza meccanica sufficiente affinché la cellula possa resistere alla pressione osmotica e la via secretoria non solo trasporta le proteine della parete cellulare verso l’esterno ma trasferisce anche i lipidi sulla membrana plasmatica per fortificare la struttura della membrana; pertanto, questi due processi possono essere responsabili dello stress anti-osmotico. Abbiamo analizzato i geni DE nella via secretoria e nella biogenesi della parete cellulare (File aggiuntivo 1: Figura S5). I geni coinvolti nella via secretoria e nella biogenesi della parete cellulare erano generalmente up-regolati in KM-100d (Gruppo①), e alcuni di essi erano anche up-regolati in KM esposti in etanolo (Gruppi ⑥ e⑦). Implica che KM-100d non solo ha mantenuto l’up-regulation nella via secretoria per KM resistente allo stress da etanolo, ma ha anche ampiamente ampliato l’ambito di attivazione della via secretoria per prepararsi all’attacco di etanolo; quindi, il miglioramento della via secretoria e della formazione della parete cellulare può essere la nuova strategia KM-100d sviluppata per sopportare lo stress osmotico causato dall’etanolo. D’altra parte, per KM e KM-100d esposti in basso etanolo (gruppi ④ e⑥), molti geni nella via secretoria erano entrambi down-regolati, suggerendo che l’attivazione della via secretoria potrebbe non essere il modo necessario per K. marxianus che risponde a basso etanolo.

Per contro lo stress ossidativo innescato dall’etanolo (Fig. 4), HYR1, che funziona come sensore e trasduttore di stress da idroperossido, è stato regolato in KM e KM-100d entrambi esposti in etanolo elevato (Gruppi ⑤and⑦). I fattori di trascrizione sensibili allo stress ossidativo SKN7 e STB5 sono stati regolati in KM-100d (Gruppo①) e in KM ad alto contenuto di etanolo (Gruppo⑦). Per lo stress antiossidante, i geni coinvolti nel sistema superossido dismutasi (ad esempio, MTM1 e PRX1) sono stati generalmente regolati in KM-100d esposti in etanolo o meno (Gruppi①, ④ e⑤). Per il sistema di tioredossina, i geni (ad es., MXR1 e TRR1) erano up-regolati in KM e KM-100d entrambi affrontati etanolo. La tioredossina e la sua reduttasi sono state anche segnalate per migliorare la tolleranza di K. marxianus a più inibitori derivati dalle lignocellulosi . Per il sistema di glutaredossina, i geni GRX2 e GLR1 sono stati regolati solo in KM-100d esposti in etanolo elevato (Gruppo⑤). Per la biogenesi dei perossisomi, geni come PEX6 e PEX7 erano up-regolati in KM-100d (Gruppo①), e alcuni altri geni (ad esempio, PEX3 e INP2) erano down-regolati in KM e KM-100d quando affrontavano etanolo basso (Gruppi ④ e⑥). Quanto sopra implica che KM-100d può globalmente rafforzare la capacità di anti-ossidazione.

Per garantire un corretto ripiegamento delle proteine sotto stress da etanolo (Fig. 4), il fattore di trascrizione dello shock termico HSF1 è stato up-regolato in KM e KM-100d ha affrontato l’etanolo basso (Gruppi ④ e⑥), un certo numero di geni chaperone-correlati (ad esempio PFD1 e CPR7) sono stati up-regolati in KM ha affrontato l’etanolo (Gruppi ⑥ e⑦), anche mantenuto up-regulation in KM-100d (Gruppo①). Alcuni geni (ad esempio CPR4) down-regulated in KM faced ethanol non erano down-regulated in KM-100d. Pertanto, KM-100d può generalmente migliorare il ripiegamento delle proteine per fornire un ambiente cellulare più stabile.

È stato riportato che in S. cerevisiae, l’accumulo di trealosio era importante per la tolleranza all’etanolo, a causa del fatto che il trealosio funzionava come soluto compatibile per prevenire l’afflusso di sali in eccesso nelle cellule di lievito ; nel frattempo, i geni coinvolti nella degradazione del trealosio erano anche indotti dall’etanolo, per regolarlo alla concentrazione ottimale . Per K. marxianus (Fig. 4), abbiamo scoperto che i geni che partecipano alla biosintesi e alla degradazione del trealosio (ad es., NTH1 e TSL1) erano comunemente up-regolati quando trattati con etanolo basso (Gruppi ④ e⑥), ma non gene up-regolato nel metabolismo del trealosio quando esposto in etanolo alto (Gruppi ⑤ e⑦). Ciò suggerisce che in K. marxianus, l’accumulo di trealosio può essere una strategia speciale per far fronte a basso etanolo, ma non ad alto etanolo.

Le espressioni differenziali di 15 geni coinvolti nelle suddette vie tolleranti all’etanolo sono state convalidate con l’analisi RT-qPCR (Fig. 5). Espressioni dei geni nel gruppo ① (Fig. 5a) erano generalmente up-regulated. D’altra parte, l’up-regolazione dei geni nel gruppo ④ (Fig. 5d) e Gruppo ⑤ (Fig. 5e) non era alto come nel gruppo ⑥ (Fig. 5b) e Gruppo ⑦ (Fig. 5 quater). La nostra analisi ha confermato che i geni che contribuiscono alla tolleranza all’etanolo sono continuamente attivati in KM-100d anche dopo il ritiro dello stress da etanolo. L’espressione genica continua potrebbe essere utile per stabilizzare l’ambiente intracellulare e beneficiare della crescita delle cellule nello stress imminente.

Validazione del consumo di etanolo potenziato e della resistenza alle sollecitazioni multiple in KM-100d

Abbiamo controllato la crescita dei lieviti KM e KM-100d in mezzo YNB con diverse fonti di carbonio (Fig. 6 bis). Sia i lieviti KM che KM-100d hanno la stessa capacità di utilizzare il glucosio come unica fonte di carbonio. Tuttavia, in presenza dell ‘ 1% e del 2% (v/v) di etanolo come unica fonte di carbonio, i lieviti KM-100d sono cresciuti meglio dei lieviti KM. Il risultato supporta la nostra ipotesi di cui sopra che i lieviti KM-100d utilizzassero l’etanolo in modo più efficiente rispetto ai lieviti KM.

D’altra parte, sulla base di Fig. 4, KM-100d possono sviluppare la resistenza agli sforzi multipli etanolo-causati simultaneamente, compreso lo sforzo osmotico, lo sforzo ossidativo e lo sforzo termico (per le proteine dello shock termico prese come chaperon per la piegatura della proteina). Per valutare le tolleranze dei lieviti a sollecitazioni multiple, abbiamo condotto il test di vitalità cellulare per varie pressioni di temperatura, ossidazione e osmotiche, rispettivamente (Fig. 6 ter-d). Nella circostanza di base (cioè, 30 °C, 0% H2O2 e 0 M NaCl), manca una differenza di vitalità tra i lieviti KM e KM-100d. Tuttavia, in presenza delle diverse sollecitazioni, i lieviti KM-100d presentano una vitalità significativamente migliore rispetto a quella dei lieviti KM. Inoltre, i vantaggi sono più significativi mentre le sollecitazioni sono diventate più gravi (Fig. 6 ter-d). Ci aspettavamo che le tolleranze a più sollecitazioni potessero introdurre nuove caratteristiche ai lieviti nella produzione di etanolo.

Abbiamo ulteriormente studiato la produttività dell’etanolo tra i lieviti KM e KM-100d sotto molteplici sollecitazioni. In circostanze di base (30 °C e 0% di etanolo, Fig. 6e), i lieviti KM e KM-100d sono quasi gli stessi sia nel consumo di glucosio che nella produzione di etanolo. Tuttavia, i lieviti KM-100d hanno mostrato vantaggi significativi in presenza di alte temperature (45 °C, Fig. 6f) o più etanolo (6% o 8%, Fig. 6g, h); l’ambiente comune di solito avveniva nella fase avanzata della fermentazione. Abbiamo condotto un’analisi RT-qPCR per i lieviti KM e KM-100d fermentati in media con etanolo al 6% a 48 h, 72 h e 120 h (Fig. 7). La maggior parte di questi geni tolleranti all’etanolo erano up-regolati in KM-100d rispetto a in KM, specialmente nella fase precedente (48 h) per l’aggiustamento iniziale all’etanolo (Fig. 7). Per riassumere, regolando le espressioni dei geni tolleranti all’etanolo, i lieviti KM-100d hanno sovraperformato i lieviti KM in ambienti stressanti con un aumento delle rese di etanolo.

Kluyveromyces marxianus sviluppo di etanolo di tolleranza durante l’evoluzione adattiva con i miglioramenti significativi di percorsi multipli