Knocking-down e Knocking-out geni

Gene Knocking-down
Questa tecnica consente la riduzione dell’espressione di uno o più di anorganism. Ciò può accadere con modificazione genetica o dal trattamento con areagent quale un oligonucleotide corto del RNA o del DNA che ha un sequencecomplementary al gene o ad una trascrizione del mRNA.
Se il cambiamento nell’espressione genica è causato da un oligonucleotide che si lega a un mRNA o si lega temporaneamente a un gene, questo porta a un cambiamento temporaneo nell’espressione genica che non modifica il DNA cromosomico e il risultato è indicato come un “knockdown transitorio”.
In un atterramento transitorio, il legame di questo oligonucleotide all’activegene o ai suoi trascritti causa una diminuzione dell’espressione. Il legame può avvenire attraverso il blocco della trascrizione, la degradazione della trascrizione dell’mRNA(ad es. siRNA o RNase-H antisenso dipendente), o attraverso il blocco ofeither mRNA traduzione, pre-mRNA splicing siti, o nucleasi clivagesites utilizzati per la maturazione di altri RNA funzionali, tra cui miRNA (e.g.by morpholino oligos).
L’uso più diretto di knockdown transitori è per conoscere un gene cheè stato sequenziato, ma ha una funzione sconosciuta. Questo approccio sperimentale è noto come genetica inversa. I knockdown transitori sono spesso utilizzati nella biologia dello sviluppo perché gli oligos possono essere iniettati in zigoti unicellulari e saranno presenti nelle cellule figlie della cellula iniettata.

L’interferenza dell’RNA (RNAi)è un mezzo per silenziare i geni mediante degradazione dell’mRNA. Gene knockdowncon questo metodo si ottiene introducendo piccoli interferingRNAs a doppio filamento (siRNA) nel citoplasma. Una volta introdotto nella cellula, esogenosirnas vengono elaborati da RISC. Il siRNA è complementare al targetmRNA da silenziare e il RISC utilizza il siRNA come modello per localizzare l’mRNA dell’obiettivo. Dopo che il RISC si localizza all’mRNA bersaglio, l’RNA viene scisso da una ribonucleasi.
RNAi è usato per l’analisi funzionale genetica. L’uso di RNAi può essere utile inidentifying i bersagli terapeutici potenziali, lo sviluppo della droga, o otherapplications.

Gene Knock-out
Geneknockout (KO) è una tecnica genetica in cui uno dei geni di un organismo ismade inoperative. Gli organismi knockout sono usati per studiare la funzione genica, di solitostudiando l’effetto della perdita genica. Kos eterozigoti e omozigoti: nel primo, solo un allele viene eliminato, nel secondo entrambi i due alleli vengono eliminati.

La creazione diretta di un KO inizia nella provetta con un plasmide,un cromosoma artificiale batterico o altro costrutto del DNA, eprocedendo alla coltura cellulare. Le cellule vengono trasfettate con il DNAconstruct. Spesso l’obiettivo è quello di creare un animale transgenico che ha ilgenetico alterato.
In tal caso, le cellule staminali embrionali vengono trasformate geneticamente e inserite nei primi embrioni. Gli animali risultanti con il cambiamento genetico nelle loro cellule germinali possono quindi spesso passare il knockout del gene alle future generazioni.

Il costrutto è progettato per ricombinare con il gene bersaglio, che viene fatto incorporando sequenze dal gene stesso nel costrutto.La ricombinazione si verifica quindi nella regione di quella sequenza all’interno del gene,con conseguente inserimento di una sequenza estranea per interrompere il gene.
Un knockout condizionale consente la delezione del gene in modo tissutale o temporale. Questo viene fatto introducendo siti loxP intorno al gene. Queste conseguenze saranno introdotte nella linea germinale tramite lo stesso meccanismo di aknock-out. Questa linea germinale può quindi essere incrociata con un’altra linea germinale contenente la Cre-ricombinasi che è un enzima virale in grado di riconoscere queste sequenze, ricombinarle ed eliminare il gene affiancato da questi siti.
Poiché la ricombinazione del dnaè un evento raro, la sequenza straniera scelta per l’inserimento di solito include un reporter. Ciò consente una facile selezione di cellule o individui in cui knockout ha avuto successo. A volte il DNAconstruct si inserisce in un cromosoma senza l’omologorecombinazione desiderata con il gene bersaglio.

(Ivana Venezia)

KNOCKDOWN
È una tecnica con cui si riduce l’espressione di un gene. Questa riduzione può derivare da una modificazione del DNA o da un legame oligonucleotidico con l’mRNA o con il gene. In questo caso la modifica dell’espressione è temporanea, quindi noiparlare di un knockdown transitorio.
Una delle tecniche che permettono l’abbattimento transitorio di un gene consiste nell’uso di oligomeri Morfolino. Sono diventati uno strumento standard di knockdown nei sistemi embrionali animali, quindi i Morpholinooligos sono spesso usati per indagare il ruolo di uno specifico trascritto di mRNA inun embrione. La sua struttura molecolare ha basi di DNA attaccate a una spina dorsale di anelli di metilenemorfolina collegati attraverso gruppi di fosforodiamidato. I morfolini bloccano l’accesso di altre molecole a piccole sequenze specifiche (~25 basi) delle superfici di accoppiamento della base dell’acido ribonucleico (RNA). A causa delle loro dorsali completamente innaturali, i morfolini non sono riconosciuti dalle proteine cellulari. Le nucleasi donot degradano i morfolini, né sono degradati nel siero o nelle cellule. Non ci sono rapporti pubblicati di Morpholinos che attivano recettori toll-like o risposte immunitarie innate come l’induzione dell’interferone o la risposta infiammatoria mediata da NF-kB.Non è noto che i morfolini modifichino la metilazione del DNA.
I morfolini non innescano la degradazione delle loro molecole di RNA bersaglio,a differenza di molti tipi strutturali antisenso (ad esempio, fosforotioati, siRNA). Invece, Morpholinosact da “blocco sterico”, legandosi ad una sequenza bersaglio all’interno di un RNA, inibendo molecole che potrebbero altrimenti interagire con l’RNA.
I morfolini possono anche modificare lo splicing del pre-mRNA o inibire la tematurazione e l’attività del miRNA.
Blocco della traduzione
Legato alla regione 5′-non tradotta dell’RNA messaggero (mRNA), i morfolini possono interferire con la progressione del complesso di iniziazione ribosomiale dal cap 5′ al codone iniziale. Ciò impedisce la traduzione della regione di codifica della trascrizione mirata (chiamata geneexpression “knocking down”). Ciò è utile sperimentalmente quando un investigatorwishes per conoscere la funzione di una proteina particolare; I morfolinos forniscono i mezzi aconvenient di abbattere l’espressione della proteina e di imparare howthat knockdown cambia le celle o l’organismo.
Modifica dei pre-mRNA splicing
Morpholinoscan interferire con il pre-mRNA fasi di lavorazione da preventingsplice-regia nucleare piccolo ribonucleoproteins (snRNP) complexesfrom vincolante per i loro obiettivi, ai confini del introni su un filo ofpre-mRNA, o bloccando il nucleofila adenina e prevenire la formazione di giunzione lariatstructure, o interferendo con il legame di giunzione di regolamentazione proteinssuch come splice silenziatori di giunzione e di esaltatori di. Prevenire il legame di snRNP U1 (nel sito donatore) o U2/U5 (nella porzione di polipirimidina e nel sito accettore) può causare splicing modificato, escludendo comunemente gli esoni dall’mRNA di natura. Il targeting di alcuni obiettivi di giunzione provoca inclusioni di introni, mentre l’attivazione di siti di giunzione criptici può portare a inclusioni o esclusioni parziali.Gli obiettivi di U11 / U12 snRNPs possono anche essere bloccati. La modifica della giuntura può essere convenientemente dosata mediante reazione a catena della polimerasi della trascrittasi inversa (RT-PCR)ed è vista come uno spostamento di banda dopo elettroforesi su gel di prodotti RT-PCR.
KNOCKOUT
Una variazione del knockout gene tradizionale è il knockout gene condizionale.
Il knockout condizionale del gene è una tecnica usata per eliminare il gene aspecifico in un determinato tessuto, quale il fegato. Questa tecnica è utilestudiare il ruolo dei singoli geni negli organismi viventi. Si differenzia fromtraditional gene knockout perché si rivolge a specifici geni a specifici timesrather che essere cancellato dall’inizio della vita. Utilizzando la tecnica geneknockout condizionale elimina molti degli effetti collaterali da knockout gene tradizionale. In knockout gene tradizionale, morte embrionale da una mutazione del gene può verificarsi, e questo impedisce agli scienziati di studiare il gene inadults. Alcuni tessuti non possono essere studiati correttamente in isolamento, quindi il gene deveessere inattivo in un determinato tessuto pur rimanendo attivo in altri. Con questotecnologia, gli scienziati sono in grado di knockout geni in una fase specifica indevelopment e studiare come il knockout di un gene in un tessuto colpisce il samegene in altri tessuti.
La tecnica più comunemente utilizzata è il sistema Cre-loxrecombination. L’enzima ricombinasi Cre riconosce specificamente twolox (loci di ricombinazione) siti all’interno del DNA e provoca la ricombinazione tra di loro. Questa ricombinazione causerà una delezione o inversione dei geni tra i due siti lox, a seconda del loro orientamento. Il gene Anentire può essere rimosso o inattivato. Questo intero sistema è inducibile in modo achemical può essere aggiunto per knock geni fuori in un momento specifico. Due delle sostanze chimiche più comunemente utilizzate sono la tetraciclina, che attiva la trascrizione del gene della ricombinasi e del tamoxifene, che attiva il trasporto della proteina crerecombinasi al nucleo. Solo pochi tipi di cellule esprimono la crerecombinasi e nessuna cellula di mammifero la esprime, quindi non vi è alcun rischio di attivazione accidentale dei siti lox quando si utilizza l’knockout del gene condizionale nei mammiferi.
Un topo contenente il gene Cre e un topo contenente le sequenze loxP sono allevati per generare un knockout condizionale per un particolare argomento di interesse. I topi non esprimono naturalmente Cre ricombinasi o loxsites ma sono stati progettati per esprimere questi prodotti genici per creare la prole desiderabile. Devi ottenere un topo in cui un esone importante è flossato (significa che ha Alox-P a monte e a valle) e un topo che ha una sequenza Cre la cui espressione è regolata da un promotore specifico di tipo cellulare o da un promotore inducibile. Poi si attraversa questi topi, che si può ottenere un mouse in cui le cellule non esprimono Cre avrà il gene con una normale funzione, mentre le cellule che esprimono Cre avrà una funzione del gene interrotto nella parte tra Lox-P.
(Francesca Luca)

RNA interferrence meccanismo

L’interferenza del RNA (RNAi), anancient cellulare risposta antivirale, è un meccanismo naturale per il silenziamento geneexpression. Può essere sfruttato per consentire l’inibizione specifica della funzione del gene anytarget. RNAi sta dimostrando di essere uno strumento di ricerca inestimabile, aiuta nell’identificazione di nuovi geni coinvolti nei processi di malattia.

L’RNAi non è l’unico meccanismo di silenziamento dell’espressione genica (tabella 1).

Tabella 1: Confronto tra diversi metodi per il silenziamento genico.

L’interferenza dell’RNA(RNAi) si verifica in risposta all’introduzione di RNA a doppio filamento (dsRNA)in una cellula. L’introduzione di dsRna innesca l’attivazione didsRNA-dipendente protein chinasi-R (PKR). Il PKR attivato fosforila il fattore di iniziazione alla traslazione EIF2: questo effetto, in associazione con l’attivazione della Rnasi-L e l’induzione della produzione di interferone, blocca la sintesi proteica e promuove l’apoptosi. Nel complesso, si ritiene che questo rappresenti un meccanismo di difesa antivirale. RNAi è un meccanismo altamente conservato in tutte le specie tassonomiche . Oltre tohave un’attività antivirale, RNAi è anche creduto per sopprimere l’espressione ofpotentially segmenti dannosi del genoma, come trasposoni, che mightotherwise destabilizzare il genoma agendo come mutageni inserzionali.

Sebbene i suoi meccanismi non siano completamente chiariti, RNAi rappresenta il risultato di un processo multistep(Figura 1). Entrando nella cellula, i DSRNA lunghi sonoprima elaborato dall’enzima RNasi III Dicer. Questo dimero funzionale containshelicase, DSRNA binding, e domini PAZ (i loro ruoli non sono completelyelucidated). Dicer produce 21-23 nucleotidi dsRNA frammenti con twonucleotide 3 ‘ sporgenze finali, cioè siRNA. RNAi è mediato dal complesso RNA-inducedsilencing (RISC) che, guidato da siRNA, riconosce mRNA contenente asequence omologa al siRNA e fende l’mRNA in un sito locatedapproximately nel mezzo della regione omologa. Quindi, l’espressione genica èpecificamente inattivata a livello post-trascrizionale.

In C. elegans, Dicer è stato mostrato per interagire con le proteine rde. Le proteine di rde legano a dsRNA lungo ed arebelieved per presentare il dsRNA lungo a Dicer per l’elaborazione. I mutanti che mostrano un alto grado di resistenza a RNAi sono stati segnalati per possedere mutazioni atrde-1 e rde-4 loci.

Figura 1: Meccanismo di RNAinterference

La comparsa di RNA doublestranded (ds) all’interno di una cellula (ad esempio come conseguenza di un’infezione virale)innesca una risposta complessa, che include tra gli altri fenomeni (ad esempioproduzione di interferone e sue conseguenze) una cascata di eventi molecolari noti come RNAi. Durante RNAi, l’enzima cellulare Dicer si lega al dsRNA e cleavesit in brevi pezzi di ~ 20 coppie nucleotidiche di lunghezza noto come smallinterfering RNA (siRNA). Queste coppie di RNA si legano all’enzima cellulare chiamato RNA-induced silencing complex (RISC) che utilizza un filamento del siRNA per legarsi a molecole di RNA a singolo filamento (cioè mRNA) di sequenza complementare. L’attività di Thenuclease di RISC poi degrada l’mRNA, così mettendo a tacere l’espressione del gene virale. Similmente, il macchinario genetico delle cellule è creduto toutilize RNAi per controllare l’espressione di mRNA endogeno, così aggiungendo un newlayer di regolazione post-transciptional. La RNAI può essere sfruttata in contesti sperimentali per abbattere i geni bersaglio di interesse con una tecnologia altamente specifica e relativamente facile (vedi testo per maggiori dettagli).

Oltre a genesilencing, RNAi potrebbe essere coinvolto in altri fenomeni di regolazione genica.. Sembra che RNAi possa anche funzionare metilando le citosine e le CpGsequences più classicamente associate alla metilazione. Se l’omologia di sequenceshares dell’obiettivo con un promotore, silenziamento trascrizionale può accadere viamethylation. Inoltre, l’RNA sembra interagire con i domini della cromatina, che alla fine possono dirigere la metilazione del DNA. Studi di C. elegans hanno dimostrato che ilrnai può diffondersi tra le cellule attraverso meccanismi che potrebbero non dipendere da siRNA.Il locus sistemico del RNA interference-deficient (sid), sid-1,codifica una conservedprotein con una sequenza peptidica del segnale e 11 domini transmembrane putativi, suggerenti che la proteina sid-1 può fungere da canale per dsRNA lungo,siRNA, o un segnale RNAi-relativo attualmente sconosciuto. Sid-1 mutanti retaincell-autonomo RNAi ma non riescono a mostrare la diffusione di RNAi. Rimane unclearwhether questo RNAi sistemico succede in mammiferi, sebbene una somiglianza forte isreported fra sid-1 e proteine umane e murine previste.

(Justine Fiorellino)

Fonte : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

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ZFN, TALEN, CRIPR / CAS9

Queste tre tecnologie molecolari consentono di editare il genoma in modo site specific, ciascuna tecnica con un meccanismo diverso. Le nucleasi a dito di zinco (ZFNs) e le nucleasi effettrici tipo attivatore di trascrizione (TALENs) sono nucleasi chimeriche composte da moduli programmabili di legame al DNA sequenza-specifici collegati a un dominio di scissione del DNA non specifico. ZFNs e TALENs permettono una vasta gamma di modificazioni genetiche inducendo le rotture del doppio filamento del DNA che stimolano l’estremità non omologa errore-incline che unisce o la riparazione omologia-diretta alle posizioni genomiche specifiche.

Immagine tratta da http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

La versatilità di ZFNs e TALENs deriva dalla possibilità di personalizzare il dominio di legame al DNA per riconoscere praticamente qualsiasi sequenza. Questi moduli di legame al DNA possono essere combinati con numerosi domini effettori per influenzare la struttura e la funzione genomica, tra cui nucleasi, attivatori e repressori trascrizionali, ricombinasi, trasposasi, metiltransferasi dell’istone del DNA e acetiltransferasi dell’istone. Pertanto, la capacità di eseguire con successo le alterazioni genetiche dipende in gran parte dalla specificità e dall’affinità del legame al DNA delle proteine del dito di zinco e del RACCONTO progettate.

Proteine del dito dello zinco di Cys2-His2

Il dominio del dito dello zinco di Cys2-His2 è fra i tipi più comuni di motivi DNA-leganti trovati in eucarioti e rappresenta il secondo dominio più frequentemente codificato della proteina nel genoma umano. Un singolo dito di zinco è costituito da circa 30 aminoacidi in una configurazione ββα conservata. Diversi amminoacidi sulla superficie dell’α-elica in genere contattano tre coppie di basi nella scanalatura principale del DNA, con diversi livelli di selettività. La struttura modulare delle proteine del zinco-dito li ha resi una struttura attraente per la progettazione delle proteine DNA-leganti su ordinazione. La chiave per l’applicazione delle proteine del dito di zinco per il riconoscimento specifico del DNA è stata lo sviluppo di matrici innaturali che contengono più di tre domini del dito di zinco. Questo progresso è stato facilitato dalla scoperta basata sulla struttura di una sequenza di linker altamente conservata che ha permesso la costruzione di proteine sintetiche a dito di zinco che hanno riconosciuto sequenze di DNA da 9 a 18 bps di lunghezza. Poiché 18 bps della sequenza del DNA possono conferire la specificità all’interno di 68 miliardo bp di DNA, questo metodo ha permesso che le sequenze specifiche fossero mirate a nel genoma umano per la prima volta.

Attivatori di trascrizione

I TALEs sono proteine naturali del genere Xanthomonas di batteri patogeni vegetali e contengono domini di legame al DNA composti da una serie di 33-35 domini di ripetizione di aminoacidi che riconoscono ciascuno un singolo bp. TALE specificità è determinata da due aminoacidi ipervariabili che sono noti come diresidues repeat-variabile (RVDs) . Come le dita di zinco, le ripetizioni di RACCONTI modulari sono collegate tra loro per riconoscere sequenze di DNA contigue. Tuttavia, a differenza delle proteine del dito di zinco, non c’era alcuna reingegnerizzazione del legame tra le ripetizioni necessarie per costruire lunghe matrici di racconti con la capacità di affrontare teoricamente singoli siti nel genoma. Oltre al loro ruolo nel facilitare l’HDR (ricombinazione diretta omologa), le nucleasi site-specific consentono anche una rapida generazione di linee cellulari e organismi con fenotipi nulli; La riparazione mediata da NHEJ di un DSB indotto da nucleasi porta all’introduzione di piccole inserzioni o delezioni nel sito mirato, con conseguente eliminazione della funzione genica tramite mutazioni del frame-shift.

Immagine presa da http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

Distinti dal sito-specifici nucleasi sopra descritto, il CRISPR (Cluster di Regolamentazione interspaced Brevi Ripetizioni)/CRISPR-associati (Cas) ha recentemente emerso come, potenzialmente, di facile ed efficiente alternativa al ZFNs e TALENs per indurre mirati alterazioni genetiche. Nei batteri, il sistema CRISPR fornisce l’immunità acquisita contro l’invasione del DNA estraneo tramite la scissione del DNA guidata dall’RNA. Nel sistema CRISPR/Cas di tipo II, brevi segmenti di DNA estraneo, chiamati “distanziatori” sono integrati all’interno dei loci genomici CRISPR e trascritti e trasformati in brevi CRISPR RNA (CRRNA). Questi CRRNA ricottura a CRRNA trans-attivanti (TRACRRNA) e scissione sequenza-specifica diretta e silenziamento del DNA patogeno da proteine Cas. Il lavoro recente ha indicato che il riconoscimento dell’obiettivo dalla proteina Cas9 richiede una sequenza “del seme” all’interno del crRNA e di una sequenza adiacente di protospacer (PAM) contenente dinucleotide conservata a monte della regione legante il crRNA. Il sistema CRISPR / Cas può quindi essere ri-mirato a fendere virtualmente tutta la sequenza del DNA riprogettando il crRNA. Significativamente, il sistema CRISPR / Cas ha dimostrato di essere direttamente portatile alle cellule umane mediante co-consegna di plasmidi che esprimono l’endonucleasi Cas9 e i componenti CRRNA necessari.

Immagine tratta da https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php