osservata la produzione di alti livelli di attività della proteasi durante il continuo cultura di K. sedentarius ha facilitato la purificazione di due proteasi, P1 e P2, che erano attive contro l’azocaseina, la catena β dell’insulina, la cheratina estratta dal callo umano e dal callo non trasformato. Le caratteristiche generali di questi enzimi, tra cui l’intervallo del substrato, la temperatura e il pH ottimali e la sensibilità agli inibitori della proteasi, suggeriscono che sono biochimicamente simili e probabilmente appartengono alla famiglia delle proteasi serine alcaline. Queste proteasi sono prodotte da un’ampia varietà di microrganismi e agiscono come endopeptidasi (Rao et al. 1998).
Se gli enzimi possono anche essere classificati come cheratinasi, tuttavia, rimane una questione di dibattito. Le cheratinasi, per definizione, dovrebbero essere in grado di idrolizzare la cheratina nativa pura. L’estrazione della cheratina, tuttavia, può essere ottenuta solo previo trattamento con agenti denaturanti per separarla dalle proteine non cheratiniche. Trattamenti meccanici come la fresatura a sfere provocano la scissione dei legami disolfuro, che rendono la proteina più suscettibile alla digestione proteolitica da parte di proteasi come la tripsina e la proteinasi K, che non sono classificate come cheratinasi (Noval e Nickerson 1959). Allo stesso modo, l’uso di substrati sterilizzati a caldo nei test della cheratinasi è stato criticato anche perché il riscaldamento può causare denaturazione della cheratina.
Sebbene nel presente studio il callo finemente macinato fosse usato come substrato enzimatico, il liquido surnatante di coltura era attivo contro pezzi di callo intatto. Pertanto, anche se le due proteasi non sono strettamente cheratinasi, degradano il callo umano in vitro e ci sono alcune prove che ciò si verifica anche in vivo (Nordstrom et al. 1987).
Anche le proteasi sono state classificate come cheratinasi a causa della loro attività sulla cheratina ridotta, nel qual caso agenti riducenti sono stati aggiunti alla miscela di saggio enzimatico o utilizzati durante l’estrazione della cheratina. Sebbene l’attività cheratinolitica di una serie di batteri cutanei sia stata studiata utilizzando la cheratina “nativa” come substrato, l’agente riducente, il ditiotreitolo (DTT), è stato incluso nella miscela di dosaggio. Ad esempio, quando l’attività apparente della cheratinasi da Staphylococcus epidermidis è stata studiata in assenza di DTT, non è stata rilevata alcuna attività (Mikx e de Jong 1987). Allo stesso modo, una serina proteasi da Candida albicans‐cheratine degradate che erano state estratte dallo strato corneo delle suole umane con 8 mol l−1 urea in Tris‐HCl e β‐mercaptoetanolo (Hattori et al. 1984). Nel presente studio, P1 e P2 hanno idrolizzato la cheratina che era stata estratta dal callo del piede umano con urea e β‐mercaptoetanolo ma, soprattutto, era anche in grado di degradare il callo non trattato.
Lo strato corneo e il callo umano è una struttura complessa e stabile di cui la cheratina è un componente importante. Ci sono 30 geni umani per cheratina di cui 18 sono espressi su pelle (Fuchs 1995). Un riassunto del database di cheratina ha dimostrato che ogni cheratina ha potenziali siti di scissione per le proteasi e Asp‐Arg e Gly‐Arg sono i più comuni. Se i filamenti di cheratina sono inizialmente rotti in queste posizioni, è possibile che la degradazione graduale di queste unità più piccole si verifichi nei siti di scissione secondaria, producendo una gamma di dimensioni di frammenti peptidici, come mostrato dall’analisi dell’attacco della proteasi sulle cheratine estratte dal callo umano. I risultati presentati in Fig. 3b indicare due pH optima per l’attività di degradazione del callo di P2. Una possibile spiegazione è che ci sono due enzimi nel campione. Ciò sembra improbabile perché il campione enzimatico utilizzato era altamente purificato,come mostrato dalla PAGINA con colorazione argento (vedi Fig. 1, corsia 6). La possibilità di due enzimi callo-degradanti nel campione P2 purificato con una mobilità molto simile a PAGINA non può essere esclusa. Tuttavia, lo stesso campione è stato testato utilizzando gli stessi tamponi con il test azocaseina e solo un pH ottimale è stato rilevato a pH 10·2. Una spiegazione alternativa è che la complessa interazione callo substrato / enzima a diversi pHs è un equilibrio di attività enzimatica e sottili cambiamenti conformazionali del substrato, che porta a dual pH optima.
Questa indagine ha dimostrato che K. sedentarius produce due proteasi extracellulari che hanno attività di degradazione del callo. Sono state determinate le informazioni di base sulle loro dimensioni molecolari relative, i loro pIs. Tuttavia, gli studi cinetici convenzionali sugli enzimi non potevano essere affrontati perché il substrato naturale utilizzato in questi esperimenti in vitro era una miscela complessa di polimeri, insolubile in acqua. L’aumento dell’attività enzimatica di P2 in presenza di sale 800 mmol 1-1 può essere rilevante per la sopravvivenza del microrganismo sulla pelle umana, che ha una concentrazione di sale variabile a seconda dell’attività della ghiandola eccrina determinata dal tasso di esercizio della persona e dalle temperature ambientali. Il meccanismo o i meccanismi coinvolti nell’effetto del cloruro di sodio non sono stati affrontati. Si suggerisce provvisoriamente che il cloruro di sodio possa influenzare la struttura terziaria dell’enzima e del substrato, o entrambi, per migliorare l’accesso del sito attivo degli enzimi ai siti specifici di scissione del substrato.
La spiegazione più semplice dei risultati osservati è che in un surnatante di coltura di K. sedentarius ci sono due enzimi degradanti del callo, le proteasi della serina, che solubilizzano anche la cheratina umana presente nel callo. È possibile che K. sedentarius produce una proteasi, codificata da un gene, e che l’attività autocatalitica o altra proteasi produce due enzimi di diversi pesi molecolari. In alternativa, ci sono due geni che codificano due enzimi indipendenti e strettamente correlati. Quest’ultima ipotesi è supportata da uno studio precedente (Holland et al. 1992). Campioni provenienti da colture continue di K. sedentarius allo steady state a differenti tassi di diluizione analizzati a PAGINA, e sovrapposti a caseina, hanno mostrato due enzimi, uno costitutivo e l’altro rilevato ad alte concentrazioni a bassi tassi di diluizione. È importante sottolineare che, a tassi di diluizione vicini a µmax, non è stato rilevato. La determinazione della sequenza aminoacidica N-terminale dei polipeptidi P1 (21 residui) e P2 (15 residui) ha mostrato che erano totalmente diversi. Questo risultato, preso insieme alle informazioni dell’esperimento di coltura continua, suggerirebbe che gli enzimi sono codificati indipendentemente.
I risultati di questa indagine hanno rafforzato l’ipotesi che specifiche proteasi di K. sedentarius possano spiegare la degradazione del callo caratteristica della cheratolisi snocciolata. Le prove fino ad oggi suggeriscono anche che due proteasi sono coinvolte e che sono attive al pH del sito cutaneo, pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). L’interpretazione dei risultati ottenuti da esperimenti in vitro all’ambiente in vivo può essere messa in discussione, anche se il callo umano è stato utilizzato come substrato. Idealmente, biopsie della pelle umana dovrebbero essere prese comprese le aree di pelle normale e snocciolate. La presenza e la posizione o l’assenza delle proteasi potrebbero quindi essere determinate mediante tecniche istologiche che utilizzano anticorpi monoclonali come sonde per le proteasi e K. sedentarius. Tuttavia, l’approvazione etica non sarebbe data per le biopsie dal luogo richiesto, il sito portante del piede, da un numero rappresentativo di persone. Il coinvolgimento di K. sedentarius nella cheratitosi snocciolata da un meccanismo di produzione di proteasi che degradano la cheratina non è stato formalmente dimostrato. Tuttavia, non ci sono prove che confutino le ipotesi e la sua credibilità è stata rafforzata dai risultati presentati qui. È stata presentata una forte evidenza in vitro che coinvolge K. sedentarius e i suoi enzimi extracellulari che degradano il callo nella condizione di cheratolisi snocciolata. A PHS della pelle normale e idratazione di superficie la produzione e l’attività di questi enzimi sarà bassa, con P1 che è il più attivo. In condizioni ambientali di occlusione e su scarsa igeina, il pH della pelle si sposta verso e leggermente al di sopra della neutralità. Queste condizioni favoriscono P2. Entrambi gli enzimi sono molto probabilmente scavenging enzimi, permettendo K. sedentarius per ottenere fonti di carbonio e azoto, piccoli peptidi, bloccato nel polimero complesso residente e insolubile, cheratina. Attualmente la regolazione della produzione di questi enzimi è sconosciuta, così come i loro contributi relativi alla degradazione del callo in vivo. Oltre alle implicazioni cliniche, le proteasi cheratinolitiche hanno un notevole valore per il settore commerciale in quanto sono utili in una serie di processi industriali tra cui la degradazione dei rifiuti di cheratina dalle industrie del pollame e della pelle (Shih 1993; Onifade et al. 1998). L’elevata attività cheratinolitica del K. le proteasi di sedentarius a temperature e pH relativamente bassi, rispetto a molte altre proteasi, presentano una potenziale applicazione di questi enzimi nell’industria biotecnologica.
