La dieta chetogenica a lungo termine induce acidosi metabolica, anemia e stress ossidativo nei ratti Wistar sani

Abstract

Background. La dieta chetogenica è stata utilizzata come terapia di supporto in una serie di condizioni tra cui epilessia, diabete mellito e cancro. Obiettivo. Questo studio mirava a studiare gli effetti del consumo a lungo termine di dieta chetogenica sui gas ematici, sui profili ematologici, sulle funzioni degli organi e sul livello di superossido dismutasi in un modello di ratto. Materiali e metodi. Quindici ratti maschi di Wistar sono stati divisi in gruppi di controllo (n = 8) e chetogenici (n = 7). Controlli ricevuto dieta standard conteneva 52,20% di carboidrati, 7,00% di grassi, e 15,25% di proteine; nel frattempo, il gruppo chetogenico ha ricevuto una dieta ricca di grassi-basso contenuto di carboidrati che conteneva 5,66% di carboidrati, 86,19% di grassi, e 8,15% di proteine. Tutti i ratti sono stati ingabbiati singolarmente e hanno ricevuto 30 g di pellet standard o ad alto contenuto di grassi e basso contenuto di carboidrati. L’esperimento è stato condotto per 60 giorni prima che i campioni di sangue fossero prelevati e analizzati per ottenere i livelli di gas ematico, conta cellulare, biomarcatori di organi e superossido dismutasi antiossidante plasmatica (SOD). Risultato. I ratti sottoposti a dieta chetogenica hanno registrato una marcata diminuzione del peso corporeo, della glicemia e un aumento dei chetoni ematici (). Il pH medio del sangue era 7,36 ± 0,02 e l’eccesso di base era -5,57 ± 2,39 mOsm / L, che erano significativamente inferiori ai controlli (). L’analisi ematologica ha mostrato livelli significativamente più bassi di eritrociti, emoglobina e ematocrito. Non sono stati riscontrati cambiamenti significativi nei livelli di alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, urea e creatinina, indicando normali funzioni epatiche e renali. Tuttavia, il livello di SOD plasma significativamente ridotto con la dieta chetogenica. Conclusione. La dieta chetogenica a lungo termine induce l’acidosi metabolica, l’anemia e il livello antiossidante ridotto dell’enzima in ratti che seguono i 60 giorni di consumo della dieta ricca di grassi-a basso contenuto di carboidrati.

1. Introduzione

La dieta chetogenica è un regime alimentare che consiste in un’alta concentrazione di grassi, con moderato/basso contenuto di proteine e molto basso contenuto di carboidrati. Questo tipo di dieta innesca un’elevata produzione di corpi chetonici derivati dalla disgregazione del grasso per produrre energia . Alcuni studi dimostrano che la dieta chetogenica ha benefici terapeutici in una serie di malattie. È stato raccomandato come terapia supplementare per la sindrome dell’ovaio policistico, l’acne, il cancro e l’afflizione respiratoria . È anche utile come terapia anticonvulsivante per ridurre la frequenza delle convulsioni nelle persone con epilessia . La dieta chetogenica può anche aiutare a ridurre i livelli di HbA1c nelle persone con diabete di tipo 2, mantenendo la stabilità dell’umore per le persone con disturbo bipolare e riducendo i livelli di colesterolo nei pazienti obesi .

Uno studio clinico ha dimostrato che una dieta chetogenica a breve termine per 14 giorni potrebbe aumentare la concentrazione di corpi chetonici nel sangue, ma ha anche migliorato la capacità antiossidante del sangue che contribuisce a ridurre lo stress ossidativo . Un altro studio clinico ha dimostrato che il consumo di dieta chetogenica per 20 giorni riduce significativamente i depositi di anidride carbonica nel corpo, che possono trovare beneficio clinico nei pazienti con aumento di PaCO2 a causa di insufficienza respiratoria .

Nonostante il suo uso popolare, sorgono alcune preoccupazioni su come la dieta chetogenica influenzerà il sistema di tutto il corpo. Poiché la dieta chetogenica sostituisce il glucosio con il grasso come principale fonte di energia, il corpo è costretto ad attivare una serie di processi metabolici grassi per acquisire energia . I processi metabolici del grasso formano l’acetil coenzima A (acetil-CoA) come prodotto principale, che quindi entra nel ciclo dell’acido citrico e viene ossidato per produrre ATP . Acetil-CoA che supera la disponibilità di ossaloacetato e / o l’attività del ciclo dell’acido citrico porta ad un aumento dei corpi chetonici (acetoacetato, β-idrossibutirrato e acetone). Questo processo è chiamato chetogenesi . I corpi chetonici formati da diete chetogeniche sono acidi; pertanto, un’eccessiva escrezione di questi acidi attraverso i reni può causare una diminuzione delle riserve alcaline o degli ioni bicarbonato (HCO3-) . Di conseguenza, l’implicazione della dieta chetogenica ha ridotto il pH del sangue, portando alla chetoacidosi .

Diversi modelli animali sono stati utilizzati per conoscere l’effetto di una dieta ricca di grassi sulla funzione degli organi vitali, come i reni e il fegato . La dieta ricca di grassi ha maggiori probabilità di innescare una riduzione del pool di chinoni mitocondriali ed è associata ad un aumento della formazione di specie reattive dell’ossigeno mitocondriale (ROS) nel fegato di ratto . Una dieta ricca di grassi ha dimostrato di indurre un’alterazione del metabolismo lipidico renale nei topi, in particolare l’equilibrio tra lipogenesi e lipolisi, portando all’accumulo di lipidi nei reni e, di conseguenza, alla disfunzione renale .

Per ottenere dati più completi su come la dieta chetogenica possa influenzare il sistema di tutto il corpo, questo studio mirava a studiare gli effetti del consumo a lungo termine di dieta chetogenica sui profili dei gas ematici, i parametri ematologici, le funzioni degli organi e il livello antiossidante in un modello di ratto.

2. Materiali e metodi

2.1. Preparazione della dieta standard e chetogenica

Il cibo standard è stato ottenuto da un produttore come pellet standard per roditori (AD2®, Indonesia), mentre il cibo chetogenico è stato preparato nel nostro laboratorio coinvolgendo un nutrizionista. I pellet chetogenici contengono il 30% di grasso non puro mescolato con il 70% di grasso di capra (Tabella 1), che è formulato sulla base del software NutriSurvey® per calcolare l’apporto calorico e la percentuale di macro e micronutrienti per grammo di pellet. Tutti gli ingredienti sono stati liquefatti e miscelati con un miscelatore a mano e poi congelati per 24 ore alla temperatura di -20°C. Il materiale solidificato è stato quindi polverizzato e modellato in pellet. I pellet standard e chetogenici sono stati quindi esaminati per il loro contenuto di grassi, proteine e carboidrati presso il Laboratorio di Chimica degli alimenti animali, Facoltà di Scienze Animali, Universitas Hasanuddin.

2.2. Protocolli sperimentali

Ratti Wistar maschi del peso di 200-330 g di età 3-4 mesi (n = 15) sono stati acclimatati per 7 giorni in laboratorio prima di iniziare l’esperimento. In questa fase, tutti i ratti hanno ricevuto pellet standard e acqua ad libitum. I ratti sono stati curati secondo lo standard per la cura degli animali da laboratorio e tutti i protocolli animali sono stati approvati dal Comitato etico degli animali della Facoltà di Medicina, Universitas Hasanuddin. I ratti sono stati divisi in due gruppi. Il primo gruppo (n = 8) ha ricevuto una dieta standard, mentre il secondo gruppo ha ricevuto la dieta chetogenica per 60 giorni. Questo periodo di 60 giorni di vita del ratto adulto equivale a 4 4 anni di vita umana . Ogni ratto è stato ingabbiato individualmente e offerto 30 g di cibo al giorno ad libitum e non sottoposto a restrizione calorica. Il cibo rimanente è stato pesato ogni mattina per registrare l’apporto calorico di ciascun ratto. I campioni di sangue sono stati prelevati dopo 60 giorni di trattamento e preparati per ulteriori analisi.

2.3. Analisi dei gas ematici, parametri ematologici, biomarcatori di organi e livello di superossido dismutasi

L’analisi dei gas ematici è stata eseguita su sangue intero di ratto immediatamente dopo il prelievo di sangue con l’uso dell’analizzatore i-Stat® (Abbott®). Per l’analisi ematologica, i campioni di sangue sono stati raccolti utilizzando un vacutainer BD® con EDTA, centrifugato per 20 min con la velocità di 3000 rpm prima di essere analizzato utilizzando un analizzatore ematologico (Thermo Scientific®). I biomarcatori di organi, come alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST), creatinina e urea sono stati misurati utilizzando Humalyzer 3500 (Human Global Diagnostic®) secondo le istruzioni sui kit di reagenti (Human®). Per misurare il livello di superossido dismutasi plasmatica (SOD), il plasma è stato preparato sulla base di istruzioni in Rat SOD for ELISA kit (Abbexa®) e analizzato con il lettore ELISA (Thermo Scientific®) enzyme-linked immunosorbent assay.

2.4. Analisi dell’attività di perossidazione lipidica nel fegato e nei tessuti renali

Alla fine dell’esperimento, i ratti sono stati anestetizzati, eutanasia e laparotomia è stata eseguita. Il fegato e i reni dei ratti sono stati rimossi e immediatamente immersi in azoto liquido. Gli organi sono stati pesati 400 mg e omogeneizzati prima di aggiungere 2 ml di soluzione tampone fosfato pH 7.4. La miscela viene centrifugata a 3000 giri / min per 20 minuti. Il surnatante (0,5 mL) è stato miscelato con 1 ml di acido tiobarbiturico all ‘1% e 1 ml di acido tricloroacetico all’ 1% e riscaldato a 100°C per 20 minuti. La miscela è stata quindi centrifugata a 3000 giri / min per 10 minuti per separare il residuo. La perossidazione lipidica degli organi è stata misurata come livello di malondialdeide (MDA) (λ = 530 nm) utilizzando uno spettrofotometro UV-VIS (Agilent®).

2.5. Analisi statistica

I dati ottenuti sono stati analizzati utilizzando il software SPSS IBM 23. La distribuzione dei dati è stata esaminata utilizzando Kolmogorov-Smirnov per determinare se i dati erano normalmente distribuiti o meno. I dati che erano normalmente distribuiti sono stati successivamente analizzati utilizzando un test t indipendente,mentre i dati che non erano normalmente distribuiti sono stati analizzati utilizzando il test Mann-Whitney U. Una differenza significativa è stata raggiunta se o una differenza molto significativa se . Tutti i dati sono stati presentati in media ± SEM.

3. Risultati

3.1. La dieta chetogenica a lungo termine sui ratti causa una significativa perdita di peso, una riduzione della glicemia e un aumento dei livelli di chetone nel sangue

La composizione alimentare del pellet chetogenico ha molto meno carboidrati (5,66% vs 52,20%) e un contenuto di grassi molto più elevato (86.19% vs 7,00%) rispetto alla dieta standard (Tabella 2). La caloria del chow standard è di 5,85 kCal / g, mentre quella del pellet chetogenico è di 8,29 kCal / g. La media dell’apporto calorico giornaliero per ratto in ogni settimana è illustrata nella Tabella 3. Si è riscontrato che il gruppo standard ha consumato più quantità di cibo rispetto al gruppo chetogenico; quindi, le assunzioni di calorie di entrambi i gruppi sono abbastanza simili nonostante la differenza di calorie per grammo di cibo.

La differenza nella composizione della dieta è stata trovata per influenzare significativamente il peso corporeo, la glicemia e i livelli di chetoni nel sangue nei ratti maschi dopo l’assunzione di 60 giorni. La tabella 4 mostra l’impatto della dieta chetogenica sul peso corporeo del ratto dopo 60 giorni. Mentre tutti i ratti alimentati con una dieta standard hanno guadagnato peso dopo 2 mesi (in media increase 25% di aumento dal peso basale), i ratti alimentati chetogenici hanno registrato una perdita di peso di circa 100 g dal loro peso corporeo basale (loss 40% di perdita).

Oltre alla perdita di peso, il livello di glucosio nel sangue dei ratti alimentati chetogenici era significativamente inferiore rispetto al gruppo dietetico standard (Figura 1). In questa fase, il valore della glicemia era di 57 ± 5,69 mg/dl, suggerendo una condizione ipoglicemica del gruppo dietetico chetogenico. Nel frattempo, il livello di chetone ematico marcatamente elevato nel gruppo chetogenico, circa 8 volte superiore rispetto ai ratti standard (7,97 ± 0,15 vs 0,34 ± 0,02 mmol/L).

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Figura 1

Il livello di glucosio nel sangue e il sangue chetone di ratti consumando standard e dieta chetogenica per 60 giorni. Il simbolo implies implica una differenza molto significativa () tra i gruppi.

3.2. La dieta chetogenica a lungo termine ha ridotto significativamente il pH del sangue e ridotto il livello di eccesso di base

L’analisi dei valori dei gas nel sangue dimostra che la somministrazione della dieta chetogenica per 60 giorni provoca un’alterazione significativa dell’omeostasi dei gas nel sangue (Tabella 5). È stato riscontrato che c’era una diminuzione molto significativa del pH del sangue dei ratti dopo 2 mesi di dieta chetogenica rispetto a quelli alimentati con una dieta standard (). La diminuzione del pH del sangue non è stata accompagnata da cambiamenti significativi nella pressione di anidride carbonica (pCO2), pressione di ossigeno (pO2), anidride carbonica totale (TCO2) e saturazione di ossigeno dell’emoglobina (SO2). Sebbene il livello di bicarbonato nel sangue () del gruppo chetogenico diminuisse in modo insignificante (19,74 ± 2,54 vs 22,75 ± 0,79 mmol/L), si è riscontrato che il livello di eccesso di base del gruppo era significativamente inferiore rispetto al gruppo standard ().

3.3. La dieta chetogenica a lungo termine induce anemia nei ratti maschi

Il risultato dell’analisi ematologica dopo aver ricevuto diete standard e chetogeniche per 60 giorni è presentato nella tabella 6. Il gruppo chetogenico sembra avere un numero di globuli rossi leggermente inferiore (RBC), emoglobina significativamente inferiore ed ematocrito, nonché indici di volume corpuscolare medio (MCV) e di emoglobina corpuscolare media (MCH) significativamente più piccoli. Queste anomalie ematologiche indicano che i ratti alimentati con la dieta chetogenica erano anemici.

3.4. La dieta chetogenica a lungo termine non altera significativamente le funzioni di fegato e reni

Questo studio ha anche misurato l’effetto di una dieta chetogenica a lungo termine nei ratti sulle funzioni epatiche e renali. Il risultato è presentato in Figura 2. Dai dati, si è rivelato che i livelli di biomarcatori epatici, l’alanina aminotransferasi (ALT) e l’aspartato aminotransferasi (AST), non erano significativamente diversi tra i gruppi standard e chetogenici. Tuttavia, confrontando il test di funzionalità renale, è stato riscontrato un leggero aumento dei livelli plasmatici di creatinina e urea nel gruppo chetogenico rispetto allo standard, sebbene la differenza non fosse statisticamente significativa.

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Figura 2

Il livello di aspartato aminotransferasi (a), alanina aminotransferasi (b), plasmatici di creatinina (c) e al plasma di urea (d) in ratti consumando standard e dieta chetogenica per 60 giorni.

3.5. La dieta chetogenica a lungo termine aumenta la perossidazione lipidica e riduce il livello antiossidante

Il livello di perossidazione lipidica e l’attività antiossidante potrebbero essere un buon indicatore per rivelare il livello di stress ossidativo nel sistema. In questo studio, è stato riscontrato che la dieta chetogenica nei ratti per 60 giorni può indurre un aumento del livello di malondialdeide (MDA) nel fegato e nei reni (Figura 3). L’aumento del livello di MDA in entrambi gli organi vitali è stato molto significativo nel gruppo chetogenico rispetto allo standard (). L’aumento del livello di MDA nel gruppo chetogenico è stato accompagnato da un livello ridotto di superossido dismutasi antiossidante (SOD), che era lower 80% inferiore rispetto a quello di standard ().

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Figura 3

Il livello di fegato di malondialdeide (a), renale malondialdeide (b), e al plasma superossido dismutasi (c) in standard e chetogenica ratti alimentati. Il simbolo implies implica una differenza molto significativa () tra i gruppi.

4. Discussione

La dieta chetogenica ha guadagnato l’attenzione pubblica da quando è stata introdotta per la prima volta come terapia alternativa per l’epilessia farmacoresistente . Oggigiorno, l’uso della dieta chetogenica si è espanso oltre la terapia epilettica; infatti, il suo uso in individui sani è diventato più popolare, specialmente per coloro che desiderano perdere peso. Sfortunatamente, i benefici della dieta chetogenica possono avere effetti collaterali. Questo studio ha esaminato gli effetti a lungo termine della dieta chetogenica in un modello di ratto maschio sano per ottenere maggiori informazioni sulle potenziali complicanze di questo tipo di dieta.

Il cibo standard con il suo alto contenuto di carboidrati consente al corpo di utilizzare il glucosio come principale fonte di energia. Quando l’assunzione di carboidrati è più che sufficiente per soddisfare le esigenze di ATP, il corpo convertirà fisiologicamente il glucosio in glicogeno come riserve di energia nei tessuti. Il consumo di una dieta ricca di carboidrati causerà anche un aumento della quantità di grasso depositato nel tessuto adiposo sotto la pelle o nella cavità addominale. Questa è la ragione principale per l’aumento del peso corporeo dei ratti alimentati con una dieta standard.

D’altra parte, i ratti trattati con la dieta chetogenica hanno avuto una significativa perdita di peso a causa della chetosi indotta. Dieta chetogenica con alto contenuto di grassi, basso contenuto di proteine, e la composizione a basso contenuto di carboidrati rende il corpo dipende dal processo di gluconeogenesi, la formazione di glucosio non carboidrato, per produrre energia . Quando gli acidi grassi (contenuto di grassi) sono utilizzati principalmente per produrre energia, indurrà la formazione di corpi chetonici, come acetoacetato, beta-idrossibutirrato e acetone. La presenza di chetosi nel gruppo chetogenico è stata confermata da un livello significativamente più alto di chetone nel sangue (∼8 mmol/L) e un livello di zucchero nel sangue significativamente basso (<60 mg/dl). Oltre alla perdita di peso, i ratti sperimentano anche una diminuzione del pH o dell’acidosi, che si verifica a causa dell’aumento del livello di chetone nel sangue . I corpi chetonici sono acidi; quindi, un aumento dei corpi chetonici in circolazione può indurre acidosi .

L’anemia non è raro effetti collaterali di diete ad alto contenuto di grassi. Questo studio ha anche trovato indici ematologici ridotti, come RBC, emoglobina, ematocrito, MCV e MCH in ratti alimentati con dieta chetogenica per i giorni 60. Studi su bambini epilettici hanno rivelato che la dieta chetogenica ha maggiori probabilità di causare anemia, che può verificarsi a causa di restrizioni dietetiche, portando a carenza di rame . Tuttavia, questa complicazione della dieta chetogenica può essere gestita con l’integrazione di rame.

In questo studio, la somministrazione di dieta chetogenica nei ratti per 60 giorni non ha alterato significativamente la funzionalità epatica e renale. Tuttavia, la creatinina plasmatica e l’urea dei ratti alimentati con chetogenica erano leggermente più alte dei ratti alimentati con standard, il che può suggerire un effetto minore della dieta chetogenica sulla funzionalità renale. Questo effetto potrebbe essere più sorprendente se la durata della somministrazione di dieta chetogenica è prolungata.

È interessante notare che, sebbene il fegato e la funzione renale non siano stati significativamente alterati, l’attività di perossidazione lipidica in entrambi gli organi è aumentata significativamente. Ciò è stato indicato da un livello significativamente più elevato di MDA nei tessuti epatici e renali nei ratti alimentati con chetogenica rispetto a quelli con una dieta standard. L’aumento dell’attività della perossidazione lipidica potrebbe essere innescato dall’innalzamento delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) negli organi e dall’incapacità dell’attività enzimatica antiossidante di proteggere le membrane cellulari dai danni indotti dal ROS. Questo risultato potrebbe emergere come una potenziale minaccia per entrambi gli organi se la dieta fosse sostenuta più a lungo del periodo studiato. In linea con ciò, la concentrazione plasmatica di superossido dismutasi (SOD) si è significativamente ridotta negli animali alimentati con chetogenica (), suggerendo la presenza di stress ossidativo indotto dalla dieta chetogenica a lungo termine nei ratti.

Il motivo per cui una dieta chetogenica può indurre stress ossidativo è stato spiegato in diversi studi. I corpi chetonici sono noti per stimolare i mitocondri a produrre più ATP rispetto al glucosio . Tuttavia, il metabolismo dei grassi richiede processi più complessi, come riduzione, ossidazione, idrossilazione e coniugazione, che possono elevare la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nelle cellule epatiche . Se il rilascio di ROS è in equilibrio con le attività antiossidanti del corpo, l’insorgenza di stress ossidativo può essere prevenuta. Al contrario, se la formazione di ROS ha superato i livelli antiossidanti, i radicali liberi attaccheranno le macromolecole, come proteine, polisaccaridi, DNA e membrane cellulari che contengono acidi grassi polinsaturi, portando a danni cellulari . Questo studio mostra un aumento dei livelli di MDA epatica e renale, che è accompagnato da una diminuzione della SOD plasmatica dopo il consumo di 60 giorni di dieta chetogenica. Ciò potrebbe implicare una precauzione sull’uso a lungo termine della dieta chetogenica.

5. Conclusioni

Nonostante la perdita di peso, il basso livello di zucchero nel sangue e l’alto chetone nel sangue, il consumo sostenibile di dieta cheto per i giorni 60 nei ratti ha anche istigato alcuni effetti riguardanti come acidosi metabolica, anemia e diminuzione del livello di enzima antiossidante plasmatico. È interessante notare che, sebbene un significativo aumento dell’attività di perossidazione lipidica sul fegato e sui reni, entrambe le funzioni degli organi sono rimaste intatte, almeno durante il periodo studiato.

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