Zebrafish manutenzione e scorte: Zebrafish (Danio rerio) sono stati raccolti in scena stabilita protocols30.Linee transgeniche utilizzati sono stati Tg(kdr-l:ras-mCherry)s91631, Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, Tg(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-mCherry)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, Tg(UAS:EGFP-UCHD)ubs1835, TgBAC(pdgfrb:GFP)ncv2236 e Tg(kdrl:EGFP)s84337. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali presso la filiale di RIKEN Kobe (IACUC).
Plasmidi e oligonucleotidi: Zebrafish marcksl1a, marcksl1b e fscn1a sono stati clonati mediante PCR da cDNA di 1 embrioni dpf utilizzando NEB® PCR Cloning kit. Tutti i costrutti di espressione utilizzati in questo studio sono stati generati tramite la clonazione Gateway® e / o la clonazione In-Fusion® utilizzando plasmidi da Tol2Kit38. Plasmidi con Marcksl1a mutato e Marcksl1b sono stati generati utilizzando Q5 ® Site-Directed mutagenesis kit (NEB). I vettori contenenti shRNA sono stati costruiti legando la sequenza shRNA tra i siti EcoRI e PmeI a valle del promotore U6 del vettore pEGFP-U6 modificato vector39 (un dono di Zuoshang Xu, Addgene plasmid #19799). Sequenza di destinazione per MARCKSL1 umano è 5 ‘-GTGTGAACGGAACAGATGATG-3’. La sequenza SHRNA strapazzata 5 ‘- GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3’ è stata progettata come una sequenza non corrispondente (sottolineata) di MARCKSL1 shRNA. I vettori contenenti mouse Marcksl1, Marcksl1-S120A/T148A/T183A (Marcksl1-AAA) e Marcksl1-S120D/T148D/T183D (Marcksl1-DDD) sottoclonati in pEGFP-N1 (Clontech)10 sono stati regali da Eleanor T. Coffey (Università di Turku). Informazioni dettagliate sui plasmidi e sui primer utilizzati in questo studio possono essere trovate nelle tabelle supplementari 1 e 2, rispettivamente.
Isolamento di RNA e sintesi di cDNA: L’RNA totale è stato isolato utilizzando TRI reagente (epigenetica) e il kit MicroPrep RNA Direct-zolTM (Zymo Research) e il cDNA è stato sintetizzato utilizzando il sistema di sintesi di primo filamento SuperScript III® (Invitrogen) secondo i protocolli del produttore.
Mosaico espressione di costrutti e linee di zebrafish transgenici: I costrutti di espressione basati su Tol2 (5-10 pg) sono stati co-iniettati in embrioni di zebrafish a una cellula con 50 pg di mRNA di trasposasi Tol2 trascritti dal vettore pCS-TP linearizzato NotI (un regalo di Koichi Kawakami, National Institute of Genetics, Giappone) utilizzando il kit mMESSAGE mMACHINE SP6 (Invitrogen). Per l’espressione mosaica dei transgeni, gli embrioni sono stati analizzati a 1 o 2 dpf dopo le iniezioni. Per generare linee Tg (fli1ep: myl9b-EGFP)rk25 e Tg(fli1ep:EGFP-PLC1δPH)rk26, gli embrioni iniettati sono stati allevati agli adulti e sottoposti a screening per i fondatori.
Generazione di zebrafish marcksl1a e marcksl1b mutanti: i mutanti marcksl1a sono stati generati dalla mutagenesi mediata da CRISPR/Cas9. Un RNA a guida singola (sgRNA) che mira al secondo esone (Fig. 4a) è stato generato utilizzando il protocollo indipendente dalla clonazione40. Il complesso Cas9 / sgRNA RNP è stato assemblato appena prima dell’iniezione e dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente 200 pg di proteina Cas9 (Invitrogen) e 100 pg di sgRNA sono stati co-iniettati in uno stadio cellulare Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l:ras-mCherry)embrione s916. i mutanti marcksl1b sono stati generati dalla mutagenesi mediata da TALEN. TALEN mira il primo esone di marcksl1b (Fig. 4b) è stato progettato utilizzando TAL Effettore nucleotide Targeter 2.0 (https:// tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) e sono stati assemblati tramite il metodo Golden gate41. TALEN repeat variable di-residues (RVD) sono stati clonati in un vettore RCIscript-GoldyTALEN (Addgene) e MRNA capped per ogni TALENs sono stati trascritti in vitro da plasmidi di espressione SacI-linearizzati utilizzando mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen). Stadio a una cella Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg (kdr-l:ras-mCherry)gli embrioni s916 sono stati microiniettati con 200 pg di RNA (100 pg di ciascun MRNA TALEN sinistro e destro). I fondatori di F0 sono stati identificati tramite l’outcrossing di TALEN o CRISPR / pesce iniettato Cas9 con pesci wildtype e lo screening della prole per mutazioni a 2 dpf utilizzando il test di endonucleasi I (NEB) T7 (per pesci iniettati TALEN) o il sequenziamento Sanger (per pesci iniettati CRISPR/Cas9). In breve, il DNA genomico è stato isolato da gruppi di cinque embrioni utilizzando il metodo hotshot42 e le corrispondenti regioni genomiche sono state amplificate. Le mutazioni sono state valutate mediante sequenziamento diretto di prodotti PCR purificati. La progenie F1 di F0 positivo è stata elevata all’età adulta e i portatori eterozigoti per le mutazioni sono stati identificati mediante fin-clipping e l’analisi PCR di genotipizzazione di routine utilizzando gli stessi primer.
Durante lo screening sono stati identificati sei alleli mutanti in marcksl1a e cinque alleli mutanti in marcksl1b (Fig. 13). Allele rk23 ospita una delezione 2-nt che porta ad un frameshift dopo aminoacido 51 e codone arresto prematuro a aminoacido 56 dopo 5 aminoacidi missense (Fig supplementare. 4 bis, lettera c). Allele rk24 ospita una delezione 5-nt che porta ad un frameshift dopo aminoacido 13 e codone arresto prematuro a aminoacido 17 dopo 4 aminoacidi missense (Fig supplementare. 4 ter, lettera d). Per questi motivi, consideriamo marcksl1ark23 e marcksl1brk24 come alleli nulli e abbiamo focalizzato le nostre indagini sulle analisi di questi mutanti.
Immagini dal vivo: gli embrioni sono stati montati nello 0,8% di agarosio a bassa fusione (Bio-Rad) in un mezzo E3 contenente 0,16 mg/ml di tricaina e 0,003% di feniltiourea. Gli z-stack confocali sono stati acquisiti utilizzando un microscopio confocale a disco rotante Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1 invertito dotato di una fotocamera CMOS Zyla 4.2 (Andor). Le immagini in campo luminoso sono state acquisite sul microscopio Leica M205FA. Le immagini sono state elaborate utilizzando Fiji (NIH).
Ablazione laser: Le ablazioni laser sono state eseguite utilizzando un laser a 405 nm (Andor) e un modulo FRAPPA (Andor) montati su un microscopio confocale invertito Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1 con un obiettivo di immersione in acqua Olympus UPLSAPO 60x/NA 1.2. Tre ablazioni laser sequenziali con un tempo di permanenza di 1000 µs ciascuna sono state applicate al 51% di potenza laser.
Microangiografia: la microangiografia è stata eseguita in wild type, marcksl1ark23, marcksl1brk24 e marcksl1ark23;embrioni marcksl1brk24. In tutto, 2 e 3 embrioni di dpf sono stati iniettati con 1-2 nL dextran tetrametil rodamina o dextran fluoresceina (MW = 2000 kDa, Invitrogen) a 10 mg/mL e imaged immediatamente. Gli z-stack confocali sono stati acquisiti con un obiettivo Olympus UPLSAPO 10× / NA 0.4. Per coprire l’intero embrione, diverse regioni sono state imaged e cucite utilizzando il plugin Stitching in Fiji43.
Trapianto di cellule: Gruppi di 15-25 cellule donatrici da marcksl1ark23;embrioni mutanti marcksl1brk24 in Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 sono stati raccolti da una posizione casuale nel blastoderm e trapiantati nella zona marginale laterale nel blastoderm44 di embrioni riceventi wildtype a 4,5–6 hpf. L’estrazione e il trapianto sono stati eseguiti utilizzando un microiniettore a olio CellTram® 4r (Eppendorf) con capillare in vetro borosilicato GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) realizzato con estrattore a micropipetta orizzontale P-87 (Sutter Instrument Co.) e una microforge MF – 900 (Narishige) per ottenere una punta liscia a forma di cucchiaio. Durante il trapianto gli embrioni sono stati tenuti in capsule di petri rivestite di agarosio con tampone 0,5 x E2 . A 2 dpf, gli embrioni con ISV mCherry-positivi sono stati selezionati per la microangiografia e l’imaging. Sono stati condotti un totale di otto trapianti indipendenti.
Trattamenti chimici: La latrunculina B (Merck Millipore) è stata sciolta in DMSO a 1 mg/ml e conservata a -20 °C. CK666 (SIGMA) è stata sciolta in DMSO a 50 mM e conservata a 4 °C. Tutti i composti sono stati diluiti alla concentrazione desiderata nel tampone E3.
Trasfezione, esperimento di abbattimento delle proteine mediato da siRNA e stress da taglio: HUVECs (Lonza, C-2519A) sono stati coltivati in mezzo EGM (Lonza) e utilizzati fino al passaggio 4. Per le trasfezioni di plasmidi, le cellule sono state seminate in mezzo Opti-MEM (Gibco) a 5,8 × 104 cellule/cm2 su poli-l-lisina e coprioggetti rivestiti di gelatina e trasfettate con 2 µg di plasmide usando Lipofectamina 3000 (ThermoFisher Scientific). Due ore dopo la trasfezione, il mezzo Opti-MEM è stato cambiato in mezzo EGM senza antibiotici. Per la trasfezione di siRNA, HUVECs (7 .9 × 104 cellule / cm2) sono state trasfettate con siRNA a 20 nM utilizzando il reagente DharmaFECT1 (Dharmacon). La trasfezione è stata ripetuta dopo 24 h. Le cellule sono state coltivate per ulteriori 24 h prima dell’estrazione o della fissazione dell’RNA totale. ON-TARGETplus umano MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) è stato utilizzato per abbattere MARCKSL1. ON-TARGETplus Non-target pool (Dharmacon) è stato utilizzato come controllo siRNA transfection. Le cellule sono state fissate con 4% PFA / PBS, permeabilizzate con 0.1% Triton X-100 e colorate con 14 µM DAPI per l’etichettatura dei nuclei, Alexa 568-falloidina (1:1000, ThermoFisher Scientific) per la visualizzazione di F-actina, e anti-VE-caderina anticorpo (1:100, Segnalazione cellulare) seguito da anti-coniglio Alexa 488 anticorpo secondario (1:1000, ThermoFisher Scientific) per marcare giunzioni CE.
Per esperimenti di stress da taglio, HPAEC (Lonza) sono stati coltivati a 1000-1500 cellule/mm2 su un piatto rivestito di gelatina all ‘ 1% in mezzo EGM-2 (Lonza) e utilizzati prima del passaggio 9. Le celle sono state esposte a sollecitazioni di taglio statiche o laminari a 15 dyn / cm2 per 0,5, 1 o 6 h utilizzando un apparecchio a piastre parallele45, 46. Un lato della camera di flusso era costituito da una lastra di vetro rivestita di gelatina all ‘ 1% su cui poggiavano gli HPAECS coltivati e l’altro lato era costituito da una lastra di policarbonato. Le loro superfici piane erano tenute a 200 µm di distanza con una guarnizione in Teflon. La camera era dotata di un ingresso e un’uscita per il fluido, e l’ingresso era collegato a un serbatoio superiore con un tubo di silicone. L’uscita era aperta ad un serbatoio inferiore. Il flusso era guidato da una pompa a rulli/tubi. Il fluido (mezzo EGM-2) è passato dal serbatoio superiore attraverso la camera di flusso nel serbatoio inferiore. La portata è stata monitorata con un misuratore di portata a ultrasuoni (HT107, Transonic Systems) posizionato all’ingresso ed è stato controllato modificando la differenza di altezza tra il serbatoio superiore e l’uscita della camera di flusso. L’intensità dello sforzo di taglio (τ, dynes/cm2) che agisce sullo strato CE è stata calcolata utilizzando la formula τ = 6µQ/a2b, dove μ è la viscosità del perfusato (poise), Q è il volume del flusso (ml/s) e a e b sono le dimensioni della sezione trasversale del percorso del flusso (cm). Dopo l’esposizione allo stress da taglio, l’RNA totale è stato isolato per qPCR.
PCR quantitativa in tempo reale: il qPCR è stato eseguito utilizzando 1 µL di cDNA, generato da 150 ng (HPAECs) o 500 ng (HUVECs) di RNA totale, in una miscela di reazione da 10 µL contenente 1X Luna Universal qPCR Master Mix (NEB) e primer forward e reverse da 400 nM. Le reazioni sono state eseguite sullo strumento ABI Prism 7900HT in quadruplicato. I dati sono stati analizzati utilizzando il software RQ Manager (Applied Biosystems) e l’espressione relativa dell’mRNA MARCKSL1 è stata calcolata con il metodo 2−ΔΔCT47 utilizzando GAPDH come gene di riferimento.
Ibridazione in situ a montaggio intero: L’ibridazione in situ a monte intero è stata condotta secondo il protocollo standard48. Gli embrioni sono stati fissati in 4% PFA a 24, 48 e 72 hpf e permeabilizzati con 10 µg/mL di proteinasi K. L’ibridazione è stata effettuata in tampone contenente 5% di sodio destrano solfato (MW = 500 kDa) a 70 °C durante la notte. Dopo il lavaggio rigoroso, i campioni sono stati bloccati con reagente bloccante al 2% (Roche) in tampone di acido maleico e incubati durante la notte con anticorpo anti-digossigenina (DIG), coniugato con fosfatasi alcalina (Roche, 1:5000) a 4 °C. Gli embrioni sono stati colorati con soluzione NBT/BCIP (Roche) in tampone di colorazione . Gli embrioni sono stati eliminati nel 70% di glicerolo durante la notte e fotografati utilizzando il microscopio Leica M205FA. Il marcksl1a e marcksl1b DIG-etichettato 1.2 kb lungo riboprobes sono stati generati da plasmidi che codificano i CDNA full-length utilizzando MEGAscript SP6 o T7 kit (Invitrogen).
Sequenziamento unicellulare dell’RNA: gli EC sono stati isolati da embrioni transgenici Tg (kdrl:EGFP)s843. L’ordinamento delle cellule è stato effettuato con FACSAriaII Cell Sorter (BD Bioscience). La sospensione a cella singola è stata caricata nel sistema 10X Chromium e le librerie cDNA sono state costruite utilizzando Chromium Next GEM Single Cell 3′ GEM, Library e Gel Bead Kit v2 (10X Genomics) secondo il protocollo del produttore. La libreria è stata sequenziata sul sequencer Illumina HiSeq 1500 (Illumina, USA). Cell Ranger v2.1 è stato utilizzato per de-multiplex raw base call (BCL) file generati dai sequencer Illumina in file FASTQ, eseguire l’allineamento, il conteggio dei codici a barre e il conteggio UMI. Le letture di sequenziamento sono state mappate sull’assemblaggio del genoma del pesce zebra (GRCz11, Ensembl release 92). Ulteriori analisi sono state eseguite utilizzando Seurat package49 nel software R (https://www.r-project.org). Le matrici di espressione sono state prima filtrate mantenendo i geni che sono espressi in un minimo di 3 cellule e le cellule che hanno espresso un minimo di 200 geni per l’analisi a valle. Le cellule sono state ulteriormente filtrate selezionando le cellule che esprimono un basso contenuto mitocondriale (<7%). I dati sono stati poi normalizzati usando la funzione NormalizedData che normalizza l’espressione genica per ogni cellula dall’espressione totale.
Quantificazione del diametro del vaso sanguigno: Live Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 transgenici wildtype o marcksl1 embrioni mutanti sono stati imaged a 50-52 hpf. Gli z-stack confocali sono stati acquisiti con un obiettivo di immersione in olio siliconico Olympus UPLSAPO 40×/NA1.25. Per i calcoli del diametro DA e PCV, sono state effettuate 4-5 misurazioni tra ISV lungo l’estensione del tuorlo (ISV n. 10-14). Per il diametro ISV, sono state effettuate in media 6 misurazioni lungo ciascun ISV (ISV n. 10-14) tra il DA e il DLAV. Le misurazioni sono state effettuate utilizzando Fiji (NIH).
Quantificazione del numero CE e proliferazione: Per contare il numero CE, 52 hpf wildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 o marcksl1ark23;embrioni marcksl1brk24 in Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 sfondo sono stati fissati in 4% PFA e macchiato con 3 µM DAPI. Gli z-stack confocali sono stati acquisiti con un obiettivo di immersione in olio siliconico Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25. I nuclei sono stati contati in ogni ISV (ISV n. 9-22) tra il DA e il DLAV. Quantificare ECS mitotici in ISV, wildtype o marcksl1ark23; embrioni marcksl1brk24 in Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg (kdr-l:ras-mCherry)lo sfondo s916 è stato fissato in 4% PFA a 30, 36 e 48 hpf, permeabilizzato in 1% DMSO / 1% Triton X-100 e macchiato con anticorpo anti-fosfo H3 (1:250, Merck Millipore) seguito da anticorpo secondario anti-coniglio Alexa 488 (1:1000, ThermoFisher Scientific) e 3 µM DAPI. Gli z-stack confocali sono stati acquisiti con un obiettivo di immersione in olio siliconico Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25. Le cellule mitotiche (cellule PH3-positive) sono state contate negli ISV su entrambi i lati dell’embrione (ISV n. 9-22). Gli ISV sono stati visualizzati utilizzando la fluorescenza mCherry. È stata rilevata solo una cella pH3-positiva per ISV indipendentemente dalla posizione dell’ISV. Durante il conteggio, abbiamo considerato EC in telofase come una singola cellula. Per contare il numero di divisioni CE, wildtype o marcksl1ark23; embrioni marcksl1brk24 in Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l:ras-mCherry) s916 sfondo sono stati imaged da 24 a 48 hpf a intervalli di 6 min utilizzando un Olympus UPLSAPO 30×/NA 1.05 silicone oil immersion objective. È stato quantificato il numero di divisioni cellulari in ciascun ISV (ISV n. 11-15).
Quantificazione dei livelli di actomiosina nella corteccia apicale: Live Tg (fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; Tg (fli1ep: EGFP-PLCδ1PH)rk26 e Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; Tg(kdr-l:ras-mCherry) s916 embrioni zebrafish sono stati imaged a 30-34 hpf utilizzando un Olympus UPLSAPO 60×/NA 1.2 obiettivo di immersione in acqua. L’intensità di Lifeact o Myl9b lungo la corteccia apicale e nel citoplasma è stata misurata usando Fiji. È stato calcolato il rapporto tra intensità corticale media e citoplasmatica.
In vivo cell shape analysis: Single-cell labelling of ECs in ISVs was achieved by mosaic expression of either fli1ep: lynEGFP plasmid in wildtype, marcksl1brk24 or marcksl1ark23;marcksl1brk24 mutant embryos or fli1ep:marcksl1b – EGFP plasmide in embrioni wildtype. A 2 dpf, è stata eseguita la microangiografia e le navi sono state riprese con un obiettivo di immersione in acqua Olympus UPLSAPO 60×/NA 1.2 con intervallo di piani Z ottici di 0.25 µm. Cell shape analysis of ECs of ISVs was performed in a semi-automated manner using a custom-written ImageJ script developed in Python, extending the method described in ref. 50. Le immagini sono state prima tagliate grossolanamente per ridurre i requisiti di memoria a valle e sono stati popolati metadati aggiuntivi (tipo di nave e identificatore di embrione). È stato quindi eseguito uno script separato per proiettare e scartare le celle da una nave su una superficie 2D. In breve, le immagini ritagliate sono state ruotate in base al tipo di vaso per allineare grossolanamente l’asse del vaso con la direzione Z in una pila di immagini e il canale dell’etichetta della cella a mosaico fluorescente è stato selezionato per la proiezione. Per superare i problemi con la segmentazione automatizzata del vaso nel canale di fluorescenza del pool sanguigno causato da strutture di fondo fluorescenti variabili e perfusione di destrano-rodamina fuori dal vaso, l’asse del vaso è stato identificato definendo manualmente la posizione del vaso approssimativamente ogni 10 µm attraverso la pila di immagini e quindi eseguendo un adattamento e un’interpolazione spline Catmull-Rom. I dati sono stati quindi trasformati in modo da raddrizzare l’asse della nave in tre dimensioni. Successivamente, la posizione di massima intensità nel canale di proiezione è stata identificata lungo i raggi a intervalli di 1° attorno all’asse del vaso. Queste informazioni sono state utilizzate per proiettare l’intensità della fluorescenza su un piano in cui gli assi sono la posizione lungo l’asse della nave e la posizione angolare e per mappare la distanza dall’asse della nave in ogni posizione sul piano proiettato. La cella è stata identificata dall’immagine proiettata utilizzando il metodo Intermodes integrato di ImageJ. Le lunghezze d’arco rappresentate dai lati di ciascun pixel associato alla cella sono state quindi calcolate (\(l = \ frac{{2 \ pi rd^2}}{{360}}\), dove r è la distanza tra il pixel associato alla cella e l’asse del vaso e d è il lato di un pixel) e utilizzato per generare misure di superficie della cella e proporzioni.
Analisi della forma cellulare in vitro: gli HUVEC fissi sono stati ripresi con un obiettivo Olympus UPLSAPO 40×/NA 1.25 per immersione in olio di silicone. In tutto, 10-20 immagini da ogni copertina sono state prese per la quantificazione e analizzate in modo semiautomatico utilizzando uno script ImageJ scritto su misura. Gli z-stack multicanale sono stati proiettati al massimo e il canale che mostra un marker GFP è stato identificato dai metadati dello strumento. Il metodo di soglia Otsu integrato di ImageJ è stato utilizzato per separare le celle di interesse dallo sfondo; le immagini binarie risultanti sono state pulite rimuovendo regioni inferiori a 105 µm2 e regioni a contatto con il limite del campo visivo. Una successiva fase di intervento manuale ha permesso all’utente di modificare facoltativamente le regioni di cella di interesse in base a questa immagine binaria per separare le celle erroneamente unite o includere le celle che sono state perse dall’operazione di soglia. Lo script ha quindi calcolato aree e perimetri per ogni ROI di cella. Inoltre, è stato calcolato un “indice di spikiness” per ogni cella in base al rapporto tra il perimetro della cella e il perimetro dello scafo convesso corrispondente e un valore per il rapporto di aspetto della cella è stato calcolato come il rapporto tra gli assi maggiore e minore di un’ellisse montata sul ROI della cella.
Analisi del blebbing della membrana: i grafici relativi al blebbing della membrana sono stati generati in modo semiautomatico utilizzando uno script ImageJ scritto su misura. Per ogni membrana imaged, il rapporto tra la lunghezza del contorno di un bordo della membrana e la distanza euclidea tra gli endpoint bordo è stato calcolato in ogni punto di tempo. Dalle serie temporali risultanti, le densità spettrali di potenza sono state calcolate con il metodo di Welch51. La densità spettrale di potenza è stata quindi mediata su una finestra di interesse, definita empiricamente come il tempo caratteristico durante il quale si sono formate le bleb (0,04-0,06 Hz); questi valori medi sono stati confrontati tra condizioni sperimentali (sovraespressione Marksl1b) e di controllo.
Analisi della dinamica di actina e miosina II nelle blebs: I grafici relativi alle dinamiche di actina o miosina nelle cellule di blebbing sono stati generati in modo semiautomatico utilizzando uno script ImageJ scritto su misura. Le pile z time-lapse multicanale sono state inizialmente proiettate al massimo lungo la dimensione z. Il software ha quindi identificato automaticamente il bordo di un bleb tra due punti di ancoraggio definiti dall’utente in tutti i punti temporali utilizzando il metodo di soglia Otsu integrato di ImageJ in esecuzione sul canale Marksl1b-EGFP come surrogato per l’etichettatura della membrana. Dopo una fase di controllo della qualità dell’utente per garantire un’identificazione accurata del bordo bleb, il profilo di intensità del canale actina/miosina lungo il bordo è stato estratto ad ogni timepoint e tracciato contro il tempo in un kymograph. In ogni punto del tempo l’intensità statistiche sono stati estratti con la bozza zona, qui definito come la z-proiettata area racchiusa dal bordo e la linea che unisce i punti su entrambi i lati della bozza di più lontano dalla bozza di punta lungo un asse perpendicolare alla linea che unisce l’utente-definito punti di ancoraggio, e la media di actina/miosina canale intensità e la vescichetta dell’area sono state tracciate contro il tempo.
Quantificazione della densità corticale dell’actina e della larghezza del fascio: Immagini ad alta risoluzione di actina in HUVECs sono state acquisite utilizzando una lente obiettivo olio Plan-APOCHROMAT 63x montata su un microscopio confocale Zeiss LSM880 dotato di un rivelatore Airyscan e GaAsP. Circa 3 µm regioni quadrate all ” interno di ogni osservazione sono stati selezionati in modo casuale e ritagliata tipicamente 8 sezioni ottiche che coprono la maglia corticale di quelle regioni. Le immagini proiettate lungo l’asse Z delle pile ritagliate sono state generate dalla proiezione di massima intensità e sottoposte alla seguente procedura. Poiché i filamenti di actina all’interno dell’immagine erano ambigui ed era impossibile valutare l’intera rete, abbiamo quantificato il numero di filamenti di actina all’interno delle regioni limitate come densità della rete di actina. Questa operazione è stata eseguita impostando le linee di scansione lungo gli assi X e Y ad ogni 4 pixel, e i valori dei pixel lungo ciascuna linea di scansione sono stati sottoposti al filtro Savitzky-Golay52 per calcolare le derivate del primo ordine. I filamenti di actina sono stati quindi identificati trovando punti di attraversamento zero, che sono i picchi di intensità della linea di scansione. I conteggi per i picchi sono stati divisi per i conteggi di pixel della linea di scansione (larghezza o altezza dell’immagine) e la densità dei filamenti sull’immagine è stata calcolata prendendo la media di questi valori.
Per quantificare la larghezza del fascio di actina, le linee centriche dei fasci di actina sono state generate trovando punti di attraversamento zero di derivati del primo ordine calcolati dal filtro Savitzky-Golay e seguiti applicando l’algoritmo di assottigliamento di Hilditch. Per eliminare la possibilità che i punti di ramificazione o di attraversamento dei filamenti di actina influenzino le misurazioni, i punti di ramificazione trovati all’interno della linea scheletrata sono stati eliminati e segmentati. L’asse ortogonale al segmento complessivo è stato determinato ottenendo l’autovettore e le intensità fluorescenti sono state campionate lungo l’asse ortogonale che esegue il centro di gravità del segmento con il metodo di interpolazione Lanczos-5. Quindi, il diametro di un filamento è stato determinato dalla larghezza della regione che ha mostrato maggiore o uguale alla metà dell’intensità di picco all’interno della linea campionata lungo l’asse ortogonale al segmento complessivo.
Statistiche: l’analisi statistica è stata eseguita utilizzando Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). Le dimensioni del campione non sono state predeterminate, gli esperimenti non sono stati randomizzati e gli investigatori non sono stati accecati all’allocazione durante gli esperimenti e la valutazione dei risultati.
Reporting summary
Ulteriori informazioni sul design della ricerca sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.
