La delezione di KDM6A, un istone demetilasi che interagisce con MLL2, in tre pazienti con sindrome di Kabuki | Jumbuck

Testo principale

La sindrome di Kabuki (KS; MIM 147920) è stata descritta per la prima volta nel 1981 da Niikawa e Kuroki,1,2 e più di 400 casi sono stati riportati in letteratura. Le principali caratteristiche cliniche sono caratteristiche facciali distintive, ritardo dello sviluppo, disabilità intellettiva da lieve a moderata, ritardo della crescita post-natale e funzionalità aggiuntive tra cui anomalie scheletriche, ipodontia e polpastrelli fetali persistenti. L’analisi comparativa del microarray dell’ibridazione genomica (CGH) non è riuscita a individuare un’anomalia ricorrente in 72 individui di KS.3-8 L’uso della strategia di exome-sequencing ha recentemente portato all’identificazione delle mutazioni di MLL2 (MIM 602113) come causa principale di KS.9 In cinque serie pubblicate di recente, mutazioni in MLL2 sono state trovate nel 56% -76% dei pazienti con KS.9-13

Poiché una percentuale significativa di pazienti non ha una mutazione MLL2 rilevabile, abbiamo postulato l’esistenza di geni aggiuntivi associati a KS. Nella ricerca di un’altra mutazione genetica che causa KS, dieci geni che interagiscono con MLL2 sono stati sottoposti a screening in 15 individui KS negativi alla mutazione MLL2 e non sono state identificate mutazioni patogene.11 Un altro gene che codifica per una proteina interagente con MLL2, KDM6A (precedentemente nota come UTX; MIM 300128), è stato sottoposto a screening in 22 individui KS negativi alla mutazione MLL2, e di nuovo non sono state rilevate mutazioni causali.13

Utilizzando l’analisi array CGH (piattaforma Agilent 244K), abbiamo identificato le microdelezioni Xp11.3 de novo in due ragazze KS belghe MLL2-mutation-negative (pazienti 1 e 2). Poiché entrambe le eliminazioni erano de novo, probabilmente sono patogene. Entrambe le eliminazioni includevano una parte o la totalità di KDM6A. Inoltre, non c’erano eliminazioni di KDM6A in una coorte di 411 controlli normali in uno studio precedente.14 La delezione nel paziente 1 includeva gli esoni KDM6A 21-29, che codificano per la parte terminale del dominio catalitico di KDM6A, e CXorf36, un gene recentemente implicato nell’autismo legato all’X.15 Nel paziente 2, KDM6A, CXorf36, DUSP21 (MIM 300678) e FUNDC1 (Figura 1) sono stati rimossi completamente. Le funzioni di DUSP21 e FUNDC1 rimangono sconosciute.

Regione Xp11.3 Mostra le eliminazioni dei pazienti

Regione Xp11.3 mostra le eliminazioni tratte dal UCSC Genome Browser (GRCh37/hg19) per i pazienti 1, 2 e 3. Le tracce complete nere rappresentano la cancellazione di ciascun paziente e il numero di ciascun paziente è superiore alla sua rispettiva traccia. La delezione nel paziente 1 si estende su 283,5 kb dalla base 44,941,324 alla base 45,224,829, la delezione del paziente 2 si estende su 815.7 kb dalla base 44,377,858 alla base 45,193,629 e la cancellazione del paziente 3 si estende su 45,4 kb dalla base 44,866,302 alla base 44,912,718. I geni nell’area sono annotati sotto le tracce di eliminazione. I CNV nel database delle varianti genomiche sono mostrati sulle linee di fondo. Non ci sono rapporti precedenti di KDM6A copia-numero modifiche.

Abbiamo quindi sequenziato KDM6A mediante sequenziamento Sanger e abbiamo cercato delezioni o duplicazioni intrageniche con un array Agilent personalizzato mirato CGH in una coorte di individui KS negativi alla mutazione 22 MLL2 (8 femmine, 14 maschi). In conformità con gli standard etici del comitato etico dell’Institut de Pathologie et de Génétique, è stato ottenuto il consenso dei genitori per l’analisi del DNA di tutti i partecipanti a questo studio e per la pubblicazione di fotografie. I dati CGH microarray (dati supplementari, disponibili online) discussi in questa pubblicazione sono stati depositati presso il Centro Nazionale per le informazioni biotecnologiche (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO)16 e sono accessibili sotto adesione GSE32567 (vedere la sezione Numeri di adesione).

Non sono state rilevate mutazioni puntiformi, ma abbiamo identificato una delezione intragenica de novo (esoni 5-9) in un individuo KS maschio italiano (paziente 3). Abbiamo anche sequenziato UTY (MIM 400009), il paralog del cromosoma Y di KDM6A (vedi sotto), e abbiamo cercato delezioni o duplicazioni intrageniche come detto sopra, ma non abbiamo rilevato alcuna mutazione.

I pazienti 1 e 3 presentavano un tipico fenotipo KS, comprendente lunghe fessure palpebrali, eversione laterale della palpebra inferiore e disabilità intellettiva da moderata a grave (Tabella 1 e Figura 2). Anche se i tratti del viso del paziente 2 non erano così classici, ha mostrato molte caratteristiche di questo disturbo, tra cui la scarsità laterale delle sopracciglia, ciglia lunghe, strabismo, lunghe fessure palpebrali, orecchie grandi e prominenti, polpastrelli fetali persistenti, coartazione aortica, pienezza areolare nell’infanzia e irsutismo. Si è presentata con un lieve ritardo dello sviluppo e ha avuto un normale quoziente di intelligenza verbale (IQ), un punteggio QI scarso e un comportamento iperattivo (Tabella 1 e Figura 2). Abbiamo notato che i pazienti 1 e 2 avevano allucinazioni lunghe (Figura 3).

Aspetto facciale negli individui affetti

(A) Paziente 1.

(B) Paziente 2.

(C) Paziente 3.

Notare le lunghe fessure palpebrali nei pazienti 1 e 2 e le sopracciglia arcuate nei pazienti 1 (lieve) e 3.

Aspetto dei piedi negli individui affetti

(A) Paziente 1.

(B) Paziente 2.

Nota le lunghe allucinazioni in entrambi i pazienti.

Pertanto, le eliminazioni di KDM6A in questi tre pazienti sono associate a un ampio spettro fenotipico che va da individui KS tipici (pazienti 1 e 3) a una presentazione clinica più lieve (paziente 2). Questa variabilità clinica è anche una caratteristica dei pazienti con mutazioni MLL2.13 Tuttavia, devono essere considerati anche i possibili effetti della delezione di CXorf36 nel paziente 1 e della delezione di CXorf36, DUSP21 e FUNDC1 nel paziente 2 sui rispettivi fenotipi.

KDM6A (29 esoni) è uno dei geni cromosomici X che sfugge in gran parte all’inattivazione X.17 Codifica una proteina di residuo 1,401 che contiene due domini funzionali. Il dominio catalitico è una demetilasi istonica che catalizza specificamente la demetilazione della lisina 27 mono-, di-e trimetilata sull’istone H3 (H3K27).18,19 Questa demetilazione media l’espressione tissutale-specifica di vari geni ed è principalmente coinvolta nei processi di sviluppo e nel ciclo cellulare.19-22 È interessante notare che KDM6A e MLL2 agiscono insieme nel controllo epigenetico della cromatina trascrizionalmente attiva contrastando le proteine del gruppo Polycomb (PcG).22 L’altro dominio funzionale di KDM6A svolge un ruolo nel rimodellamento della cromatina interagendo con il complesso di rimodellamento switch/saccarosio non fermentabile (SWI/SNF) che contiene l’attivatore di trascrizione Brg1.23

Come MLL2, KDM6A svolge un ruolo nell’embriogenesi e nello sviluppo. Omozigote dUTX (Drosophila KDM6A ortholog) Drosophila mutanti manifestano occhi ruvidi, ali dismorfiche, e la modifica dei pettini del sesso.21 Questo fenotipo assomiglia al fenotipo del tritorace, sostenendo ulteriormente l’idea che KDM6A contrasta la repressione del PcG.21 Inoltre, UTX-1 (C. elegans KDM6A ortholog) potrebbe influenzare le decisioni sul destino dello sviluppo nelle cellule precursori vulvali di C. elegans attraverso la regolazione della trascrizione dei geni che codificano il complesso proteico del retinoblastoma (RB), che è stato conservato dai vermi agli esseri umani.20 Kdm6a1 è anche importante nell’espressione dei geni HOX posteriori nel pesce zebra.19 Inoltre, KDM6A, insieme a MLL2, svolge un ruolo importante nella regolazione dei geni muscolo-specifici durante l’embriogenesi.22,24 Infine, i membri di un’altra importante famiglia di geni dello sviluppo (geni T-box, che agiscono nel mesoderma nella formazione del cuore e delle vertebre) reclutano KDM6A per attivare i loro geni bersaglio, sottolineando nuovamente il ruolo di KDM6A nei processi di sviluppo.23 È interessante notare che la maggior parte delle mutazioni patogene per i geni T-box riportati nelle malattie umane si trovano nel dominio T-box che interagisce con KDM6A.23

KDM6A sfugge all’inattivazione X,17 ma è stato suggerito che nei topi, l’espressione di Kdm6a dal cromosoma X inattivo è significativamente inferiore a quella del cromosoma X attivo.L’espressione di 25 Kdm6a è più alta nel cervello adulto, nel fegato adulto e nelle regioni specifiche del cervello in via di sviluppo nelle femmine rispetto ai maschi.25 UTY è il paralog di KDM6A sul cromosoma Y.17 has ha 84% somiglianza sequenza aminoacidica con KDM6A e potrebbe compensare l’aumentata espressione di KDM6A nelle femmine, nonostante il fatto che l’attività demetilasi deve ancora essere dimostrata per questo paralog KDM6A.14,25

Non è sorprendente trovare un altro gene associato a KS sul cromosoma X perché ci sono state segnalazioni di pazienti simili a KS con cromosomi X (r) ad anello piccolo.26-34 Inoltre, vi è una chiara sovrapposizione tra i difetti cardiaci congeniti prevalenti nei pazienti maschi con KS (coartazione aortica e altre ostruzioni del lato sinistro) e quelli riscontrati nei pazienti con cromosomi monosomia X e r(X).28,35 Piccoli cromosomi r (X) tipicamente portano alla sindrome di Turner attraverso la completa inattivazione della r(X). Tuttavia, non è chiaro il motivo per cui alcuni individui sviluppano un fenotipo simile a KS. L’inattivazione incompleta del cromosoma X e la successiva espressione di geni solitamente repressi sono state suggerite come spiegazione del fenotipo KS in alcuni pazienti r(X).32-34 KDM6A è stato eliminato nei tre pazienti che avevano sia un fenotipo simile a KS che un r(X) in cui erano stati mappati i punti di interruzione; questo risultato è coerente con l’ipotesi che la delezione di KDM6A giochi un ruolo importante nel fenotipo simile a KS osservato in alcuni pazienti con un r(X).30,32,34 Non siamo stati in grado di dimostrare l’aploinsufficienza per KDM6A nei pazienti 1 e 2 perché l’espressione di KDM6A era molto bassa nei linfociti del sangue periferico (dati non mostrati). Tuttavia, gli studi hanno dimostrato che due copie di Kdm6a sono necessarie per la normale espressione in embrioni di topo femmina e topi adulti25,suggerendo che l’aploinsufficienza potrebbe essere il meccanismo patogeno. Tuttavia, questa spiegazione non spiegherebbe il fatto che 45, X e altri pazienti r(X) con una delezione KDM6A non sviluppano tutti il fenotipo Kabuki.

Nei pazienti 1 e 2, i rapporti di inattivazione molecolare X sono fortemente inclinati e sono 89:11 e 97:3, rispettivamente. Il profilo di inattivazione X è stato determinato tramite l’amplificazione PCR della ripetizione CAG nell’esone 1 del gene del recettore degli androgeni prima e dopo la digestione del DNA con HpaII e CfoI. Per determinare se la copia eliminata di KDM6A si trovava sul cromosoma X attivo o inattivo, abbiamo eseguito un’analisi di ibridazione in situ (FISH) a fluorescenza con una sonda KDM6A sui cromosomi X che erano stati etichettati in modo differenziato dall’incorporazione di 5-bromo-2′-deossiuridina (5-BrdU). I risultati hanno mostrato che la copia eliminata di KDM6A si trovava sul cromosoma X inattivo in tutte le 70 mitosi analizzate in entrambi i pazienti (Figura 4). Il fatto che KDM6A sfugge all’inattivazione x17 suggerisce che i linfociti stimolati dalla fitoemagglutinina (PHA) che hanno una copia eliminata di KDM6A sul cromosoma X inattivo hanno un vantaggio di sopravvivenza rispetto alle linee cellulari che hanno una copia eliminata di KDM6A sul cromosoma X attivo. Questo suggerimento è in linea con l’ipotesi che sebbene KDM6A sfugga all’inattivazione X, la sua espressione è inferiore dal cromosoma X inattivo rispetto al cromosoma X attivo.25

Immagine dello studio FISH sui cromosomi X Etichettati in modo differenziale con 5-BrdU

Un’immagine di uno studio FISH mostra i cromosomi X etichettati in modo differenziale con l’incorporazione di 5-BrdU. Il cromosoma X inattivo (nel cerchio bianco) appare più luminoso del cromosoma X attivo. Le sonde subtelomeriche Xqter si ibridano ad entrambi i cromosomi X (frecce blu). Il segnale KDM6A (freccia bianca) è assente dal cromosoma X inattivo ed è presente sul cromosoma X attivo. Per questo esperimento, i linfociti del sangue periferico dei pazienti 1 e 2 sono stati stimolati con fitoemagglutinina e sono stati coltivati per 72 ore. Al fine di identificare il cromosoma X inattivo tardivo, abbiamo trattato le cellule con 5-BrdU (30 µg/ml) 5 ore prima della raccolta. Colcemid è stato quindi aggiunto ad una concentrazione di 0,2 µg/ml, e 1 ora dopo, i preparati di metafase sono stati prodotti tramite procedure standard che hanno comportato gonfiore in KCl 75 mM e fissaggio in metanolo 3:1/acido acetico. Abbiamo eseguito l’analisi dei PESCI utilizzando simultaneamente una sonda Xqter subtelomerica etichettata con SpectrumOrange (Vysis) per indicare i cromosomi X (freccia blu) e RP11-435K1 etichettata con SpectrumOrange (AmpliTech) per distinguere tra i cromosomi X eliminati e non eliminati (freccia bianca). Per facilitare il rilevamento del 5-BrdU incorporato, abbiamo denaturato il DNA cellulare in 2N HCl per 30 min a 37°C. 5-BrdU è stato quindi etichettato con un anticorpo monoclonale specifico 5-BrdU coniugato alla fluoresceina (Roche) (1 µg/ml). Infine, abbiamo contrastato il DNA applicando una soluzione antifade contenente 0.1 µg/ml DAPI.

Il ruolo di UTY è in gran parte sconosciuto e non ha attività di demetilasi in vitro. Il ritrovamento di un individuo maschio di KS (paziente 3) con una delezione intragenica di KDM6A e con severità clinica simile a quella del paziente 1 suggerisce che UTY potrebbe parzialmente compensare la perdita di KDM6A in individui maschii, come precedentemente suggerito nella letteratura.25

Per quanto riguarda MLL2, mutazioni somatiche omozigote ed emizigote in KDM6A sono state identificate in vari tipi di cancro (mieloma multiplo, carcinoma a cellule squamose esofagee, carcinoma a cellule renali, leucemia mieloide, cancro al seno, cancro colorettale e glioblastoma), suggerendo che KDM6A è un gene che sopprime il tumore.14 Tuttavia, il cancro non è una caratteristica chiave di KS, dato che questa complicazione è stata riportata solo in sette pazienti KS36, 37 (leucemia linfoblastica acuta, linfoma di Burkitt, sarcoma fibromixoide, sarcoma sinoviale ed epatoblastoma sono stati riportati una volta e neuroblastoma è stato riportato in due individui KS).35,36 Se la perdita di entrambi gli alleli è sufficiente a causare il cancro, ci si aspetterebbe che il cancro si verifichi più frequentemente in KS, come nel retinoblastoma (MIM 180200) o nel tumore di Wilms (MIM 194070). Ciò suggerisce che la perdita del secondo allele in MLL2, KDM6A, o UTY è necessaria ma non sufficiente per lo sviluppo del cancro o che questa complicazione è sottovalutata, dimostrando l’importanza degli studi di storia naturale nelle sindromi rare.37

Le seguenti istone metilasi e istone demetilasi sono state implicate in altre sindromi con anomalie multiple: EHMT1 (MIM 607001; Sindrome di Kleefstra ), SETBP1 (MIM 611060; Sindrome di Schinzel-Giedion ), JARID1C (MIM 314690; Claes-Jensen-type, sindrome da ritardo mentale X-linked ), PHF8 (MIM 300560; Siderius-tipo, sindrome da ritardo mentale X-linked), e MLL2 in KS. L’identificazione delle mutazioni patogene di KDM6A nei pazienti con KS espande il ruolo dei fattori di modifica dell’istone nella disabilità intellettiva e nella malformazione congenita.

In conclusione, riportiamo le mutazioni di KDM6A come causa di KS in un maschio e due femmine. I nostri risultati confermano sia l’eterogeneità genetica di KS che un locus sul cromosoma X, come è stato suggerito in precedenza. Poiché alcuni pazienti con KS erano negativi al sequenziamento di MLL2, KDM6A e XT e non mostravano eliminazioni o duplicazioni durante lo screening, è probabile che altri geni associati a KS rimangano da scoprire.