CASE REPORT
La paziente era una bambina di 3 anni con forma totale del colon della malattia di Hirschsprung. Il giorno 2 di vita (27 aprile 2006), è stato eseguito un intervento chirurgico d’urgenza per occlusione dell’intestino tenue a causa di atresia, con rimozione di 31 cm di intestino tenue, seguita da ileostomia terminale e colostomia. Era quindi necessaria una nutrizione parenterale totale. Il 25 agosto 2006, una porta di accesso vascolare impiantabile per via sottocutanea (Cook Spectrum Central Venous Catetere, Cook Ireland Ltd.) è stato posto per la nutrizione parenterale domestica dopo una rimozione accidentale del catetere Nutricath (Vygon, Francia).
Quattro mesi dopo (dicembre 2006), è stato osservato il primo episodio settico, con sette campioni di sangue positivi prelevati attraverso il catetere e da una vena periferica. La febbre si è risolta prontamente dopo l’inizio della terapia antimicrobica che combinava vancomicina (40 mg/kg di peso corporeo/die, 10 giorni) e gentamicina (3 mg/kg/die, 2 giorni). Gli isolati di sangue sono stati identificati per la prima volta come Micrococcus spp. utilizzando gallerie biochimiche di routine e successivamente come Kocuria rhizophila utilizzando strumenti molecolari. Successivamente, altri sette episodi settici con K. rhizophila (due nel 2007, quattro nel 2008 e uno nel 2009) sono stati osservati e risolti con la stessa terapia antimicrobica. Poiché si presumeva che la colonizzazione del catetere fosse la causa della sepsi, l’etanolo si blocca (70% di etanolo è stato instillato nel lume del catetere per 12 h e poi è stato ritirato dal lume del catetere; quindi, è stata eseguita una vampata isotonica di cloruro di sodio) sono stati fatti nel catetere durante gli ultimi quattro episodi associati agli antibiotici sistemici (17). Al momento dell’ultimo evento settico nel 2009, è stato rilevato un foro nel catetere e riparato utilizzando uno specifico kit di riparazione. Dopo l’aprile 2009, non è stato osservato alcun nuovo episodio settico.
Durante il periodo di 3 anni (2007-2009), utilizzando il sistema tridimensionale BacT/Alert (3D) (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia), sono state ottenute un totale di 22 emocolture positive, con 21 campioni prelevati dal catetere e uno da una vena periferica. Tutte le colture hanno prodotto cocchi Gram-positivi che si verificano in coppie, tetradi e cluster che sono stati preliminarmente identificati come specie di Micrococcus con caratteristiche di base. Le colonie crescevano in condizioni aerobiche e apparivano lisce e circolari con una sfumatura giallo limone o color crema sull’agar del sangue. Gli isolati erano catalasi positivi, ossidasi negativi, sensibili alla bacitracina e resistenti al furazolidone. Solo poche reazioni positive sono state trovate con la galleria di stafilococco ID 32 (bioMérieux), producendo Staphylococcus auricularis con una probabilità debole del 57%. Nel 2006 e nel 2007, il ceppo clinico è stato considerato Micrococcus senza altre indagini nel processo di identificazione. Nel 2008, abbiamo utilizzato la scheda Vitek 2 ID – GPC (bioMérieux) che ha prodotto Kocuria varians con un apparente punteggio di fiducia “eccellente” (98%). Ha mostrato solo un singolo test discordante (urea) poiché è apparso negativo per questa specie, mentre dovrebbe essere positivo nell ‘ 87% degli isolati di K. varians. Per chiarire questo test discordante e confermare K. varians, abbiamo usato l’analisi del gene 16S rRNA. L’estrazione del DNA e l’analisi della sequenza genica 16S rRNA sono state eseguite come descritto in precedenza (16). La procedura è stata eseguita su 11 isolati clinici: quattro recuperati nel 2006, sei nel 2008 e uno nel 2009. Sorprendentemente, tutte le sequenze ottenute hanno mostrato un’identità completa a quelle di K. rhizophila depositate nel database nucleotidico GenBank. La sequenza genica 16S rRNA dell’isolato K. rhizophila ha mostrato una somiglianza del 98% (457/466) con quella del gene 16S rRNA del ceppo K. rhizophila DC22201 (GenBank accession no. NC010617) e ha mostrato somiglianza con le sequenze di altri 10 ceppi di K. rhizophila, incluso il ceppo di tipo storico K. rhizophila TA68T di Kovacs (GenBank accession no. NR_026452; somiglianza del 99%) e Micrococcus luteus NCTC 2665 (GenBank accession no. NC012803; somiglianza del 93%). Altre specie di Kocuria hanno mostrato una somiglianza di 451/462 per Kocuria carniphila e 452/467 per Kocuria marina. Infine e recentemente, abbiamo utilizzato la spettrometria di massa a tempo di volo (MALDI-TOF MS) con desorbimento laser assistito da matrice (6), confermando il ceppo come K. rhizophila. I profili spettrali di quattro isolati clinici erano identici al profilo spettrale del ceppo di tipo K. rhizophila (Fig. 1) e ben distinti dai profili di Kocuria kristinae, Kocuria palustris, Kocuria rosea e Kocuria varians, tutti presenti nel database Andromas. With the disk diffusion method, all the isolates were resistant to ciprofloxacin, intermediate to erythromycin, and susceptible to penicillin, gentamicin, amikacin, tobramycin, tetracycline, vancomycin, and teicoplanin, according to EUCAST breakpoints determined for Staphylococcus spp. since there are not breakpoints available for Kocuria spp. With broth microdilution, MICs were 0.03 mg/liter for penicillin, 0.5 mg/liter for gentamicin, 1 mg/liter for amikacin, 2 mg/liter for tobramycin, 8 mg/liter for ciprofloxacin, 4 mg/liter for erythromycin, 0.125 mg/liter for tetracycline, 0.5 mg/litro per vancomicina e 1 mg / litro per teicoplanina.
Profili spettrali MALDI-TOF MS. Le prime quattro linee, quattro isolati clinici di K. rhizophila dal nostro paziente; ultima linea, ceppo di tipo K. rhizophila utilizzato nel database Andromas.
La genotipizzazione di isolati clinici con la tecnica PCR arbitrariamente innescata richiedeva tempi di rampa prolungati, come riportato da Ellinghaus et al. (8). È stato eseguito su 9 isolati rappresentativi degli otto episodi settici e ha mostrato lo stesso schema, che rappresenta un K clonale. ceppo rhizophila recuperato per 3 anni (Fig. 2).
Modelli di PCR innescati arbitrariamente di ceppi di K. rhizophila. Corsie: M, scala del DNA; 1, ceppo tipo DSM 11926; 11, K. rhizophila da un altro paziente (ceppi dalle corsie 1 e 11 sono estranei); 2 e 3, due isolati dal primo settico episodio; 4, isolare dal secondo episodio; 5, isolare dal terzo episodio; 6, isolare dal quarto episodio; 7, isolare dal quinto episodio; 8, isolare dal sesto episodio; 9, isolare dal settimo episodio; 10, isolare dall’ultimo episodio settico; 12, controllo negativo. Le corsie da 2 a 10 hanno schemi simili, che indicano lo stesso ceppo.
Le specie micrococcal sono state trovate in polvere, suolo, acqua e cibo e sulla pelle e sulla mucosa di esseri umani e animali. I membri di questi gruppi di specie inoltre sono stati trovati per causare le infezioni quali la meningite, l’endocardite e la polmonite, particolarmente in pazienti immunocompromessi ed infezioni relative ai dispositivi impiantati o inseriti (18, 21, 30). Tra il genere Kocuria recentemente istituito, i casi umani documentati di infezioni sono limitati. La specie tipo K. è stato riportato che rosea causa batteriemia correlata al catetere (2). Un altro membro del genere, K. kristinae, è stato anche segnalato per causare una batteriemia correlata al catetere in pazienti con cancro ovarico (3) o colecistite acuta (14). Nel 2009, due casi di peritonite causata da K. marina sono stati segnalati da Lee et al. (12). Più recentemente, nel 2010, Lai et al. (11) batteriemia riferita catetere-riferita ed endocardite infettiva causata da Kocuria sp., mentre Tsai et al. (27) ha riportato un’infezione da K. varians associata ad ascesso cerebrale.
Mentre K. rhizophila è stato isolato da alimenti come formaggio (7) e carne di pollo (1), a nostra conoscenza, il nostro caso è il secondo rapporto di infezione umana K. rhizophila dopo il primo descritto da Becker et al. nel 2008 (4). Mentre la fonte del nostro ceppo K. rhizophila persistente di 3 anni non era chiara, è possibile che facesse parte della flora cutanea residente del paziente, colonizzando il dispositivo intravascolare in diverse occasioni. Il dispositivo intravascolare a lungo termine (3 anni) probabilmente ha fornito una nicchia per il ceppo persistente K. rhizophila, ricorrente attraverso il foro nel dispositivo. La riparazione del dispositivo danneggiato sembrava impedire il verificarsi di qualsiasi nuovo episodio settico fino ad ora. Tutto il personale del reparto è ora spesso ricordato la rigorosa applicazione del protocollo asettico per quanto riguarda la gestione del catetere venoso centrale. Attualmente, il bambino è in buona salute e ha sempre feci liquide. La nutrizione parenterale potrebbe essere ridotta a 5 giorni a settimana.
La galleria di stafilococco ID 32 non ha permesso un’identificazione affidabile di K. rhizophila poiché il database di questo kit diagnostico disponibile in commercio include solo un numero limitato di specie micrococcali, non copre le specie descritte di recente e non riflette la tassonomia stabilita da Stackebrandt et al. (23). La scheda ID-GP Vitek 2 identificava ambiguamente diverse specie di Kocuria (K. varians, K. kristinae e K. rosea) ma non K. rhizophila. Inoltre, l’errata identificazione degli stafilococchi coagulasi-negativi come Kocuria mediante analisi biochimica standard da parte del sistema Vitek 2 non è rara, a causa della variabilità fenotipica (5). Al contrario, l’uso dell’analisi del gene 16S rRNA o MALDI-TOF MS è stato adeguato per ottenere un’identificazione accurata di K. rhizophila.
Sono attualmente disponibili pochi dati sulla suscettibilità antimicrobica di Kocuria spp. o altri micrococci e, inoltre, non è stato ancora definito alcun regime terapeutico generalmente accettato per infezioni gravi. Nel 1995, von Eiff et al. (29) MICS determinati di parecchi farmaci su 188 ceppi micrococcal: MIC90s (mg/litro) di rifampicina, penicillina, imipenem, ampicillina, clindamicina, cefotaxime, vancomicina/teicoplanina e gentamicina erano, rispettivamente, ≤0.031, 0.125, 0.125, 0.25, 0.25, 1, 1/1, e 1, mentre i MIC90 di amikacina, eritromicina, fosfomicina e acido fusidico erano >2 mg/litro. Nel nostro caso, il ceppo era suscettibile alla vancomicina e alla gentamicina e la combinazione di questi due farmaci permetteva sempre la sterilizzazione delle emocolture.
In conclusione, se un organismo simile a micrococci viene ripetutamente isolato da emocolture, è importante utilizzare mezzi diversi dai sistemi biochimici di routine, come il sequenziamento del gene 16S rRNA o MALDI-TOF MS, per ottenere un’identificazione accurata delle specie. Si raccomanda inoltre di verificare attentamente l’integrità dei dispositivi intravascolari a lungo termine e riparare i danni per salvare le linee centrali dal dover essere rimosso.
Sequenza nucleotidica numero di adesione.
La sequenza genica 16S rRNA dell’isolato di K. rhizophila è stata presentata a GenBank con il numero di adesione JQ272742.
