Introduzione
La biotecnologia impiega microrganismi e cellule superiori e i loro principi attivi con l’obiettivo di ottenere conversioni desiderabili di vari substrati (Tripathi et al., 1997). L-fenil acetil carbinolo è il materiale di partenza per la sintesi chimica di L-efedrina idro cloruro e pseudo efedrina composti farmaceutici utilizzati come decongestionanti, antiastmatici (Shin e Rogers, 1995) e recentemente riportati, utilizzati nel controllo dell’obesità (Astrup et al., 1992). Substrato aromatico la benzaldeide darà L-PAC con il metodo di biotrasformazione. Alcuni ceppi di lievito possiedono enzimi piruvato decarossilasi (PDC) e alchol deidrogenasi (ADH) che producono L-PAC e alcool benzilico, un sottoprodotto, rispettivamente dalla benzaldeide (Nikolova e Ward, 1991). I potenziali di biotrasformazione delle cellule crescenti liberano le cellule raccolte le cellule immobilizzate e l’enzima grezzo e purificato isolato sono stati ampiamente studiati (Liew et al., 1995; Shin e Rogers, 1996a, b).
Il ruolo dei nuovi ceppi nella bioconversione è un aspetto importante. La produzione di L-PAC è stata studiata da cellule libere e immobilizzate di saccharomyces cerevisiae in varie condizioni di crescita e biotrasformazione. Ma abbiamo studiato la produzione di L-PAC dalla benzaldeide utilizzando vari nuovi ceppi in varie modalità di crescita e biotrasformazione al fine di monitorare le condizioni ideali che consentono la massima resa del prodotto a concentrazione costante del substrato e densità cellulare. La produzione di L-PAC è riportata nello schema 1.
| Schema 1: | |
Materiali e metodi
Produzione di L-fenil Acetil carbinolo con cellule normali di Sccaromuces Cerevisiae (BY)
La produzione di L-Pac (un intermedio chiave per molti farmaci) dalla benzaldeide dai lieviti è la via potenziale nell’industria della fermentazione per la produzione di efedrina e altri farmaci. Il presente studio è stato condotto dall’autore nel Sultan-Ul-Uloom college of Pharmacy, situato a Hyderabad, in India nell’anno 2004.La coltura del lievito di panetteria è stata appena subculturata (Ellaiah e Krishna, 1987) su inclinazioni medie sterili fresche di YEMA e incubata a temperatura ambiente (circa 28°C) per 36 h. Quindi la coltura 36 h è stata utilizzata per la raccolta. La coltura del lievito di panetteria è stata raccolta agitando in 5 mL di acqua sterile. La sospensione microbica raccolta è stata trasferita nel mezzo di inoculo – I. La composizione del mezzo di inoculo è la seguente:
Il pallone è stato incubato a 28°C su un agitatore rotante (180 giri / min) per 24 ore.
Il conteggio microbico è stato effettuato utilizzando la camera di conteggio Neubauer. La sospensione microbica è stata diluita in modo che ogni ml di sospensione contenesse 200×106 cellule. Dieci millilitri di inoculo da IM-I sono stati trasferiti a 100 ml di mezzo di inoculazione – II la composizione dell’oms è indicata di seguito:
I flaconi sono stati incubati su un agitatore rotante (180 giri / min) per 16 h.
Sono stati preparati cento millilitri di mezzi di produzione. Nella maggior parte dello studio, il mezzo di melassa utilizzato come mezzo di produzione e per lo studio di confronto il mezzo di succo di canna da zucchero con urea è stato utilizzato come mezzo di produzione. Dieci millilitri di inoculo da IM-II sono stati trasferiti a mezzi di produzione la cui composizione è uguale a IM-II e incubati per 9 h su agitatore rotante. A 9 h, il nutriente (20 ml di melassa 50%) è stato aggiunto al mezzo di produzione di melassa e il nutriente (20 mL di succo di canna da zucchero 50%) è stato aggiunto al mezzo di produzione di canna da zucchero rispettivamente e incubato su agitatore rotante. Dalle ore 10 in poi 0.6% di benzaldeide distillata è stato aggiunto in 6 dosi divise di intervalli di mezz’ora al mezzo di produzione.
Quindi i flaconi sono stati incubati sull’agitatore rotante per 24 h. i flaconi contenenti 130 mL di brodo (cioè 100 ml di mezzo di produzione+10 mL di inoculo + 20 ml di mezzo nutritivo) sono stati trattati con 130 mL di benzene (solvente) e agitati per l5 min in imbuti di separazione. Quindi lo strato organico è stato separato e filtrato attraverso cotone assorbente. Infine il benzene solvente è stato distillato per ottenere il prodotto L-PAC.
Produzione di L-fenil Acetil carbinolo con nuovi isolati di lieviti:
Procedure per la bioconversione:
In studi comparativi le nuove culture sono state utilizzate per stimare e confrontare il loro potenziale di biotrasformazione con il lievito panettiere. Le colture stock di Candida pseudointermedia MTCC No. 6225, Candida pseudountermedia MTCC No. 6352 e Issatchenkia orientalis MTCC No. 6351 sono state sottoculturate asetticamente su inclinazioni YEMA Strile con ciclo di trasferimento sterilizzato nell’area sterile (flusso d’aria laminare).
La procedura precedentemente menzionata (Ellaiah e Krishna, 1987) è stata ripetuta anche per i nuovi ceppi. Nella maggior parte dello studio il mezzo di melassa è stato utilizzato come mezzo di produzione e per lo studio comparativo il mezzo di succo di canna da zucchero con urea (Kaur e Kocher, 2002) è stato utilizzato come mezzo di produzione.
Risultati e discussione
L-Fenil acetil carbinolo è un liquido di colore giallo. Il suo peso specifico riportato è 0,93 a temperatura ambiente. L-PAC prodotto da isolati tra cui lieviti panificatori (S. cerevisia) ha mostrato lo stesso valore di peso specifico. Il valore del pH di L-PAC (rapporto 1: 1 tra il campione di L-PAC e l’acqua) è riportato come 3.84. In questi esperimenti il prodotto L-PAC ottenuto attraverso la biotrasformazione da quattro diversi lieviti come lievito di birra, Candida pseudointermedia (6225), Candida pseudointermedia (6352) e Issatchenkia orientials (6351) ha mostrato gli stessi valori di pH. Il valore Rf di L-PAC è stato riportato (Groger ed Erge, 1965) nel cloroformio come fase mobile su vapori di iodio di gel di silice sono stati utilizzati per la rilevazione di macchie.
Nello sviluppo dei cromatogrammi il cloroformio come solvente frontale è stato confrontato con la miscela di solventi (30% acetato di etile 70% esano) come fase mobile. Il fronte solvente successivo ha mostrato una migliore separazione rispetto al cloroformio. Quindi abbiamo usato il 30% di acetato di etile e il 70% di esano come fronte solvente in tutti i nostri esperimenti.
L-PAC è reattivo anche alla luce UV, ai vapori di iodio e alla carbonizzazione del β-metossinaftalene. Il valore Rf di L-PAC standard è di circa 0,33. Il prodotto L-PAC di diversi isolati ha mostrato lo stesso valore Rf.
Il metilchetone presente in L-PAC subisce la reazione di Idoform (Smith e Hendlin, 1954). Subisce inizialmente l’alogenazione e la scissione in presenza di alcali come NaOH per dare origine all’Idoform. Questa reazione è molto specifica per L-PAC e non si verifica con i sottoprodotti. L-PAC prodotto da diversi isolati ha dato origine a Idoform.
Con stime polarimetriche e colorimetriche, la percentuale di bioconversione è stata stimata in diversi isolati di lievito. Altri prodotti di fermentazione (ad esempio, alcool benzilico, acido benzoico e benzaldeide non convertita sono stati analizzati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e gascromatografia (GC). La struttura chimica di L-PAC è stata identificata e conforme ai dati spettrali 1H NMR e UV.
Diversi lavoratori (Ellaiah e Krishna, 1987) hanno condotto la fermentazione in melassa come mezzo di produzione, oltre a quello nell’industria utilizzare il mezzo di melassa per la reazione di bioconversione nella produzione di L-PAC.
Nella presente inchiesta abbiamo provato il succo di canna da zucchero come mezzo di produzione nella produzione di L-PAC. Il succo di canna da zucchero con urea allo 0,25% è stato utilizzato come mezzo di produzione che ha prodotto più prodotto di L-PAC rispetto alla melassa. Oltre a questo l’estrazione del prodotto dal mezzo di succo di canna da zucchero era molto conveniente rispetto al mezzo di melassa. La percentuale di bioconversione ottenuta con diversi isolati di lievito è riportata nella Tabella 1.
Il potenziale di biotrasformazione delle cellule libere del lievito panettiere (S. cerevisiae) è stato studiato sia nella melassa che nel succo di canna da zucchero come mezzo di produzione. Nella melassa è stata osservata una bioconversione media del 25%, mentre nel succo di canna da zucchero è stata osservata una bioconversione media del 28%.
| Tabella 1: | Conversione di melassa e succo di canna da zucchero, come la produzione di supporti per la produzione di L-PAC |
Biotrasformazione il potenziale di libera cellule di Candida pseudointermedia MTCC N. 6225 è stato studiato in melassa e succo di canna da zucchero come mezzo di produzione. Nella melassa è stata osservata bioconversione del 23,43%, mentre nel succo di canna da zucchero è stata osservata bioconversione del 23,75%.
Potenziale di biotrasformazione di cellule libere di Candida pseudointermedia MTCC No. 6352 è stato studiato sia nella melassa che nel succo di canna da zucchero come mezzo di produzione. Nella melassa è stata osservata bioconversione del 33,47%, mentre nel succo di canna da zucchero è stata osservata bioconversione del 48,76%.
Il potenziale di biotrasformazione delle cellule libere di Issatchenkia orientalis MTCC No. 6351 è stato studiato sia nella melassa che nel succo di canna da zucchero come mezzo di produzione. Nella melassa è stata osservata una bioconversione del 37,16%, mentre nel succo di canna da zucchero è stata osservata una bioconversione del 60,61%.
Conclusione
In conclusione la presente procedura per l’utilizzo di nuovi ceppi di lieviti provenienti da fonti naturali per studi di biotrasformazione è stata studiata e utilizzata per la bioconversione della benzaldeide in L-PAC. Tre ceppi sono stati isolati da diverse fonti naturali come uva nera, frutta data e succo di canna da zucchero e sono stati identificati presso l ” Istituto di tecnologia microbica, Chandigarh. Questi tre ceppi sono stati designati come Candida pseudointermedia MTCC No. 6225 (BGY), Issatchenkia orientials MTCC No. 6351 (DY), Candida pseudointermedia MTCC No. 6352 (SCY).Che costituirà un’importante aggiunta alle attuali procedure esistenti. I risultati più significativi della presente ricerca sono l’uso di 3 nuovi ceppi di lieviti per la produzione di L-PAC e l’uso di succo di canna da zucchero come mezzo di produzione per la produzione di L-PAC. Siamo riusciti in entrambi i tentativi e c’è un notevole aumento della resa percentuale di L-L-PAC quando il succo di canna da zucchero è stato utilizzato come mezzo di produzione. Sebbene il succo di canna da zucchero sia costoso rispetto alla melassa, la procedura di estrazione si è dimostrata molto più semplice con il succo di canna da zucchero rispetto alla melassa. Ulteriori modalità di ricerca come diversi fattori, studi di immobilizzazione, studi di mutazione ecc., potrebbe aiutare a stabilire i metodi redditizi per la produzione di L-PAC usando il succo di canna da zucchero come mezzo di produzione. Questo è il primo rapporto sull’utilizzo di Candida pseudointermedia e Issatchenkia orientalis per studi di bioconversione della benzaldeide in L-PAC. L’uso del succo di canna da zucchero come mezzo di produzione negli studi di biotrasformazione della benzaldeide in L-PAC è anche il primo rapporto del suo genere. Inoltre il succo di canna da zucchero ha mostrato un aumento del potenziale di bioconversione rispetto al mezzo di melassa. I nuovi ceppi che possiamo esplorare per le diverse reazioni chimiche. Ulteriori studi in questa direzione sono in corso.
Riconoscimenti
Gli autori sono grati a IMTECH, Chandigarh per aver identificato i nuovi ceppi e assegnato i numeri MTCC.
