Profilo funzionale Valutazione del Lactobacillus fermentum TCUESC01: Un nuovo potenziale ceppo probiotico isolato durante la fermentazione del cacao

Abstract

L’uso di batteri probiotici intestinali è molto comune nell’industria alimentare ed è stato al centro della maggior parte delle ricerche in questo campo. Eppure negli ultimi anni, la ricerca sui microrganismi extraintestinali è notevolmente aumentata a causa del loro noto potenziale come probiotici. Così, abbiamo studiato un ceppo di Lactobacillus fermentum (TCUESC01) estratto dal cacao in fermentazione. In primo luogo, abbiamo esaminato l’impatto del pH sulla crescita di questo ceppo e studiato la sua sopravvivenza in condizioni simili a quelle del tratto gastrointestinale umano. L. fermentum TCUESC01 ha dimostrato resistenza alle condizioni che imitano lo stomaco e l’intestino umano e si è sviluppato bene tra pH 5 e pH 7. Successivamente, abbiamo sottoposto L. fermentum TCUESC01 allo stoccaggio a 4°C in una soluzione di latte e abbiamo scoperto che è sopravvissuto bene per 28 giorni. Infine, abbiamo misurato la suscettibilità di questo ceppo a numerosi antibiotici e la sua tendenza ad autoaggregarsi. L. fermentum TCUESC01 ha mostrato un’autoaggregazione significativa, così come la suscettibilità alla maggior parte degli antibiotici testati. Nel complesso, i nostri risultati supportano il potenziale uso di questo batterio extraintestinale come probiotico alimentare.

1. Introduzione

La ricerca di nuovi probiotici è motivata dalla consapevolezza che ogni ceppo di microrganismi possiede proprietà diverse e potrebbe avere effetti unici sulla salute umana. Storicamente, si credeva che i batteri lattici nei prodotti probiotici dovessero provenire da esseri umani a causa della specificità dell’ospite . Tuttavia, i microrganismi extraintestinali isolati da alimenti contenenti lattosio fermentati o verdure fermentate mostrano anche promettenti effetti probiotici . Prove preliminari dal nostro laboratorio indicano che i ceppi di Lactobacillus derivati dalla fermentazione di cacao di alta qualità presentano proprietà probiotiche: riducono il danno istologico, riducono la concentrazione sistemica di citochine infiammatorie e aumentano i livelli sierici di IgA in un modello sperimentale in vivo di colite . Tuttavia, il possibile utilizzo di questi ceppi in prodotti commerciali dipende da una serie di test raccomandati dalle organizzazioni internazionali. Secondo l’Organizzazione delle Nazioni Unite per l’alimentazione e l’agricoltura (FAO) e l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), i potenziali ceppi probiotici dovrebbero essere valutati per le loro caratteristiche funzionali e tecnologiche, compresa la loro resistenza durante il transito gastrointestinale e la loro stabilità durante lo stoccaggio . Pertanto, abbiamo valutato le proprietà funzionali e la sicurezza del ceppo Lactobacillus fermentum TCUESC01 che è stato isolato durante la fermentazione di cacao di alta qualità.

2. Materiali e metodi

2.1. Microrganismi e condizioni di crescita

Il ceppo Lactobacillus fermentum TCUESC01 (numero di adesione KU244478, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU244478)) è stato coltivato in lactobacilli MRS broth (1% peptone, 0,8% estratto di carne, 0,4% estratto di lievito, 2% glicosio, 0,5% acetato di sodio, 0,2% fosfato di idrogeno dipotassico, 0,02% solfato di magnesio eptaidrato, 0.005% solfato di manganese tetraidrato e 0,02% sale di triammonio acido citrico) (HIMEDIA®, India) per 18 ore a 37°C e conservato a -80°C in una soluzione di latte al 10% (Molico®, Brasile) contenente 30% di glicerolo.

2.2. Analisi della crescita e della vitalità con pH variabile

MRS soluzioni di brodo di pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 e pH 9 sono state preparate con aggiunta di 1 mol·L−1 di acido cloridrico o 1 mol * L-1 di idrossido di sodio. Prima della prova, L. fermentum TCUESC01 è stato coltivato per 18 h e poi diluito in una soluzione salina (0.85% di cloruro di sodio) ad una densità ottica (OD) di 0,3 misurata a 600 nm (OD600 = 0,3). Le prove sono state eseguite in micropiastre a 96 pozzetti (Costar®), in cui 180 µL di MR a ciascun pH sono stati inoculati con 20 µL di coltura attiva o soluzione salina come controllo. La micropiastra è stata incubata a 37°C e il OD a 600 nm è stato determinato ogni ora per 10 ore utilizzando uno spettrofotometro (Molecular Devices®, Versamax tunable micropiastre reader). Parallelamente, i campioni sono stati prelevati ogni ora da ciascun pH, placcati su MRS agar e incubati in condizioni anaerobiche a 37°C per testare la vitalità cellulare.

2.3. Tolleranza in vitro alle condizioni gastrointestinali

I batteri sono stati coltivati a 37 ° C durante la notte in 40 ml di brodo MRS, lavati in una soluzione salina e inoculati in 20 ml di una soluzione di latte al 10%. La fermentazione del latte è stata lasciata procedere fino a raggiungere un pH di 4.5, a quel punto i batteri sono stati contati (CFU * mL-1) mediante diluizione seriale e placcatura su MRS agar. Inoltre, è stata effettuata una diluizione seriale in una soluzione salina (pH 2,5) con pepsina (3 g/L), seguita da incubazione a 37°C per 1,5 h. I batteri sono stati lavati con due cicli di centrifugazione (5000 ×g / 10 min) e risospensione in soluzione salina, prima di essere risospesi in 20 mL di bile suina all ‘ 1% a pH 8.0 (Merck®, Germania) e incubati a 37°C per 45 minuti. La conta batterica (CFU·mL−1) è stata determinata placcando la soluzione batterica in MRS agar in condizioni anaerobiche a 37°C per 48 h dopo ogni fase di incubazione.

2.4. Sopravvivenza durante la conservazione a freddo in latte acidificato

Il ceppo L. fermentum TCUESC01 è stato coltivato in brodo MRS e poi raccolto per centrifugazione (5000 ×g/10 min). I batteri sono stati poi lavati mediante risospensione in una soluzione salina e nuovamente pellettati mediante centrifugazione. Le colture sono state inoculate in una soluzione sterile di latte non grasso al 10% acidificato a pH 4,5 con acido lattico (Synth®, Brasile). La soluzione lattica è stata refrigerata a 4°C e le unità formanti colonie (CFU·mL-1) sono state contate mediante diluizione seriale e placcatura su MRS agar a 0, 7, 14, 21 e 28 giorni. La vitalità del ceppo è stata determinata in relazione al punto di tempo zero, che è stato considerato avere una sopravvivenza al 100%.

2.5. Analisi di Autoaggregazione

L. fermentum TCUESC01 è stato coltivato in 20 ml di brodo MRS durante la notte a 37°C. Il pellet batterico è stato raccolto e risospeso in soluzione salina a un OD di 0,3 a 600 nm (OD600 = 0,3). La capacità di L. fermentum TCUESC01 per l’autoaggregazione è stata testata incubando la sospensione a 37°C e il OD è stato monitorato ogni ora per 5 h. L’aggregazione percentuale () è stata calcolata come segue: dove è la densità ottica iniziale al punto di tempo zero ed è la densità ottica al momento della misurazione. I risultati mostrati erano le medie più / meno le deviazioni standard da tre esperimenti.

2.6. Test di sensibilità agli antibiotici

L. fermentum TCUESC01 è stato coltivato per 18 ore in brodo MRS a 37°C e diluito a 0,5 sulla scala McFarland in una soluzione salina. I dischi antibiotici sono stati posti su piastre di agar Mueller-Hinton che sono state poi inoculate con 100 µL della sospensione di batteri attivi. Le piastre sono state quindi incubate in condizioni anaerobiche per 24 ore a 37°C. Le zone di inibizione attorno ai dischi sono state misurate e i batteri sono stati classificati come resistenti (), moderatamente suscettibilità (MS) o sensibili () in base agli standard delineati nella Tabella 1. I dischi antibiotici utilizzati nel test di suscettibilità sono stati amoxicillin (AMO, LABORCLIN®, Brasile, 10 µg), ciprofloxacina (CIP, LABORCLIN, il Brasile, il 5 µg), amikacina (AMI, CECON®, Brasile, 30 µg), azitromicina (AZI, CECON, Brasile, 15 µg), amoxicillina e acido clavulanico (AMC, SENSIFAR®, Brasile, 30 µg), norfloxacina (NÉ, LABORCLIN, Brasile, 10 µg), sulfonamide (SUL, NEWPROV®, Brasile, 300 µg), vancomicina (VAN, SENSIFAR, Brasile, 30 µg), streptomicina (EST, LABORCLIN, Brasile, 10 µg), eritromicina (ERI, CECON, Brasile, 15 µg), tetraciclina (TET, SENSIFAR, Brasile, 30 µg), imipenem (IPM, CECON, Brasile, 10 µg), cefalotin (CFL, LABORCLIN, Brasile, 30 µg), gentamicina (GEN, CECON, Brasile, 10 µg), cefotaxime (CTX, SENSIFAR, Brasile, 30 µg), cotrimoxazole (trimetoprim e sulfametossazolo) (SUT, SENSIFAR, Brasile, 25 µg), cloramfenicolo (COAGULI, SENSIFAR, Brasile, 30 µg), clindamicina (CLI, CECON, Brasile, 2 µg), penicillina G (PEN10, CECON, Brasile, 10 µg), e cefoxitina (CFO, LABORCLIN, Brasile, 30 µg).

2.7. Analisi statistiche

I calcoli delle medie e delle deviazioni standard, le analisi della varianza, i test di confronto multipli di Tukey e tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il programma software GraphPad® Prism 5.0. Tutti i grafici sono stati prodotti anche utilizzando il programma GraphPad Prism 5.0.

3. Risultati

3.1. Effetto del pH sulla crescita e la vitalità di L. fermentum TCUESC01

L. fermentum TCUESC01 è stato in grado di crescere in media a pH 5, pH 6 e pH 7 (Figura 1). Tuttavia, la crescita non è stata osservata al di fuori di questo intervallo di pH (Figura 1).

(a)

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(e)

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Figura 1

Crescita di Lactobacillus fermentum TCUESC01 nel periodo da 0 a 10 ore di culture a 37°C in diverse pH: (a) la crescita del MRS senza modificazione di pH (pH 6.52); (b) la crescita in la SIGNORA con pH 2; (c) la crescita SIGNORA con pH 3; (d) la crescita SIGNORA con pH 4; e) la crescita SIGNORA con pH 5; (f) la crescita SIGNORA con pH 6; g) crescita della MRS con pH 7; h) crescita della MRS con pH 8; i) crescita della MRS con pH 9. Ogni punto del grafico rappresenta la media e la deviazione standard da tre esperimenti.

3.2. Tolleranza di L. fermentum TCUESC01 alle condizioni gastrointestinali In Vitro

La tolleranza di L. fermentum TCUESC01 al passaggio gastrointestinale è stata valutata in condizioni progettate per imitare il tratto gastrointestinale umano (Figura 2). Una soluzione batterica è stata coltivata ad una concentrazione di 8,7 × 108 CFU * mL-1 in una soluzione di latte al 10%. Dopo aver sottoposto i batteri a una soluzione contenente pepsina a pH 2,5 per 1,5 h per simulare il succo gastrico, abbiamo osservato una riduzione statisticamente significativa () della concentrazione batterica a 1,23 × 108 CFU * mL-1. Dopo essere stati lavati con soluzione salina, i batteri sono stati quindi sottoposti a una soluzione di bile suina all ‘ 1% a pH 8,0 per 45 minuti per simulare l’ambiente intestinale. A seguito di questo trattamento, abbiamo osservato una riduzione di circa 1 log nella conta batterica (3,6 × 107 CFU·mL−1). La riduzione della conta batterica durante l’incubazione nel succo intestinale simulato non era statisticamente insignificante.

Figura 2

Sopravvivenza del Lactobacillus fermentum TCUESC01 durante il passaggio attraverso il tratto gastrointestinale simulato. “Latte fermentato” dopo la fermentazione del latte; “succo simulato dello stomaco” dopo il passaggio in soluzione salina pH 2,5 + pepsina;” succo intestinale simulato ” dopo il passaggio nella bile di bue 1%. Ogni punto del grafico rappresenta il deviante medio e standard di tre esperimenti. Riduzione statisticamente significativa () in relazione a ” latte fermentato.”

3.3. Sopravvivenza di L. fermentum TCUESC01 in condizioni di conservazione commerciale

Per valutare la loro sopravvivenza durante lo stoccaggio, i batteri L. fermentum sono stati refrigerati a 4°C per 28 giorni in un latte 10% non grasso altrimenti sterile acidificato a pH 4,5 con acido lattico (Figura 3). Il ceppo batterico era inizialmente ad una concentrazione di 3,6 × 109 CFU * mL-1, ma dopo 7 giorni di conservazione abbiamo osservato una riduzione statisticamente significativa di circa 1 log nella conta batterica. Dal giorno 7 al giorno 21, c’è stata una crescita inaspettata da 4,3 × 108 CFU·mL−1 a 9,0 × 108 CFU·mL−1. Al giorno 28, la concentrazione batterica era diminuita a 2,83 × 108 CFU·mL−1.

Figura 3

Sopravvivenza del Lactobacillus fermentum TCUESC01 nel latte fermentato da 0 a 28 giorni, a 4°C. Ogni punto rappresenta la deviazione media e standard di tre esperimenti. “a”: differenza statisticamente significativa rispetto al giorno zero (); “b”: differenza statisticamente significativa rispetto al giorno 14; “c”: differenza statisticamente significativa rispetto al giorno 21.

3.4. Autoaggregazione di L. fermentum TCUESC01

I batteri si sono aggregati sempre più fino alla quinta ora di coltura in vitro, a quel punto è stata osservata un’aggregazione massima di 70,19 ± 1,78% (Figura 4). Tuttavia, gli aumenti orari dell’aggregazione percentuale erano solo statisticamente significativi fino alla terza ora dell’esperimento ().

Figura 4

Percentuale di autoaggregation di Lactobacillus fermentum TCUESC01 valutata dal 1 ° al 5 ° ora di coltivazione in MRS broth a 37°C. “a”: statisticamente significativa differenza in relazione alla 1 ° ora di aggregazione; “b”: statisticamente significativa differenza in relazione alla 2a ora di aggregazione . Ogni punto rappresenta la deviazione media e standard di 3 esperimenti.

3.5. Suscettibilità di L. fermentum TCUESC01 agli antibiotici

Questo ceppo di L. fermentum showed susceptibility to the majority of antibiotics tested (Table 2). The few exceptions were the fluoroquinolones norfloxacin and ciprofloxacin, the nucleic acid synthesis inhibitors sulfonamide and cotrimoxazole (sulfamethoxazole and trimethoprim), the cell wall synthesis inhibiting glycopeptide antibiotic vancomycin, and the cell wall synthesis inhibiting β-lactam cefoxitin. L. fermentum TCUESC01 era suscettibile all’amoxicillina, all’amoxicillina e all’acido clavulanico, alla penicillina G, ai β-lattamici cefotaxime e cefalotina, agli aminoglicosidi amikacina e gentamicina, alla lincosamide clindamicina, al carbapenem imipenem, ai macrolidi azitromicina ed eritromicina, al fenicolo cloramfenicolo e alla tetraciclina. Il ceppo era anche moderatamente suscettibile alla streptomicina.

4. Discussione

Linee guida stabilite dalla FAO e dall’OMS affermano la necessità di analizzare le proprietà funzionali e la sicurezza dei batteri prima di proporne l’uso in una matrice alimentare . Inizialmente abbiamo valutato la capacità di questa specie di Lactobacillus di crescere e sopravvivere a pH diversi, e sebbene abbia mostrato una crescita solo nell’intervallo da pH 5 a pH 7, è rimasta vitale durante le incubazioni 10-h a tutti i livelli di pH valutati, ad eccezione del pH 2. Gli studi hanno dimostrato un’ampia variabilità del pH gastrico quando lo stomaco è vuoto, con valori medi inferiori a pH 4 . L’ambiente intestinale è più stabile e varia tra pH 6 e pH 8, a seconda della regione intestinale valutata . Pertanto, anche se questo batterio lattico non ha mostrato la capacità di moltiplicarsi o sopravvivere al di sotto di pH 2.5, rimane vitale nell’intervallo di pH intestinale e quindi può essere in grado di funzionare in quell’ambiente. Coerentemente con i nostri dati, Lactobacillus plantarum (ST194BZ, ST414BZ e ST664BZ), Lactobacillus rhamnosus (ST461BZ, ST462BZ) e Lactobacillus paracasei (ST242BZ, ST284BZ) isolati da una bevanda fermentata comunemente consumata (Boza) dalla penisola balcanica hanno mostrato buoni tassi di crescita durante 10 h di incubazione tra pH 5 e pH 7 . L plantarum 423 isolato dalla bevanda di sorgo, L. plantarum 241 isolato dall’ileo suino, L. curvatus DF38 isolato dal salame e Lactococcus lactis ssp. lactis HV219 isolato dalle secrezioni vaginali umane ha anche mostrato una crescita tra pH 5 e pH 6.5 in esperimenti simili . Nel complesso, i nostri risultati dimostrano che L. fermentum TCUESC01 ha una crescita e una resistenza al pH simili ad altri potenziali batteri probiotici extraintestinali. Inoltre, la sensibilità del ceppo a livelli di pH inferiori a 2,5 può essere superata con l’uso di metodi che proteggono i batteri, come la microincapsulazione . I nostri risultati supportano la potenziale applicazione di questo ceppo come additivo probiotico in alimenti con caratteristiche distintamente acide, ad esempio formaggi, succhi e latte fermentato.

L’ambiente gastrointestinale può essere ostile per molti batteri; una varietà di fattori di stress come acidità, enzimi digestivi e sali biliari possono influenzare negativamente la loro sopravvivenza durante il transito verso l’intestino . Il Lactobacillus in questo studio ha mostrato una discreta riduzione quantitativa ma è rimasto vitale in condizioni gastriche e intestinali e ha resistito a una concentrazione di bile tre volte quella riscontrata nell’intestino umano (0,3%) . Simile ai nostri dati, Kaushik et al. osservato che Lactobacillus plantarum Lp9 è diminuito di circa 0,5 log dalla sua concentrazione iniziale quando esposto a condizioni che imitano lo stomaco (pH 2) e 1 log quando esposto a condizioni che imitano l’intestino. In un altro studio, L. rhamnosus VT1 / 1 isolato dal formaggio ha mostrato una riduzione di circa 2 log in concentrazione in condizioni di basso pH (pH 3) e una riduzione di 1 log in concentrazione quando incubato a pH 7 in presenza di 2% sali biliari . I nostri risultati suggeriscono che L. fermentum potrebbe muoversi attraverso il sistema gastrointestinale e sopravvivere in concentrazioni superiori a 107 CFU·g−1 (o CFU·mL−1), che studi precedenti suggeriscono sarebbe sufficiente per interagire e/o interferire con l’ambiente ospite .

La matrice alimentare è anche un fattore che influenza la vitalità dei microrganismi durante la loro conservazione . Nel testare la sopravvivenza a lungo termine di L. fermentum TCUESC01 nel latte acidificato, abbiamo osservato una riduzione iniziale della conta batterica seguita da un leggero aumento dal giorno 7 al giorno 21. Questa crescita può essere spiegata dal continuo metabolismo batterico nella soluzione lattica, sebbene a una velocità ridotta a causa della bassa temperatura. Donkor et al. anche osservato variazione quantitativa nei batteri probiotici durante la conservazione a 4 ° C, in particolare Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lb1466 che ha mostrato una crescita di 1 registro dal giorno 7 al giorno 14 di conservazione frigorifera. In un altro studio, L. plantarum conservato nel latte fermentato ha ridotto significativamente la sua concentrazione cellulare di 1 log durante circa 28 giorni di conservazione a 4°C . Sebbene L. fermentum avesse mostrato una diminuzione di 1 log dalla sua concentrazione iniziale entro l’ultimo giorno di conservazione, la sua concentrazione era superiore alla media alla data di scadenza della soluzione lattica . Allo stesso modo, sulla base delle raccomandazioni dell’Agenzia nazionale per il monitoraggio sanitario (ANVISA), L. fermentum TCUESC01 potrebbe essere introdotto in matrici alimentari simili al latte fermentato e sopravvivere in concentrazioni adeguate fino alla data di scadenza del prodotto .

I microrganismi con la capacità di autoaggregarsi rimangono nell’intestino per un tempo più lungo e quindi hanno migliori interazioni con le cellule epiteliali e il sistema immunitario ospite . Il ceppo L. fermentum TCUESC01 ha dimostrato un’elevata capacità di autoaggregazione nel nostro studio di 5 ore. Questo risultato è superiore a quello riportato da Beganović et al. , che ha dimostrato che L. fermentum A8 aveva 60,9 ± 3.91% di autoaggregazione dopo 5 ore di incubazione, o quella riportata da Bao et al. , who ha dimostrato l’autoaggregazione di meno di 28% per 10 ceppi di L. fermentum dopo un’incubazione di 20 ore. Sulla base dei nostri risultati, L. fermentum si aggrega bene e se ingerito sarebbe probabilmente in grado di persistere nell’ambiente intestinale umano per lunghi periodi di tempo.

Infine, abbiamo valutato la suscettibilità di TCUESC01 a una varietà di antibiotici. La conoscenza della suscettibilità agli antibiotici è estremamente importante se consideriamo tre fattori importanti: la rara possibilità di infezione da Lactobacillus, il rischio di trasferimento orizzontale di geni di resistenza ai microbi nativi e l’associazione tra batteri probiotici e trattamento antibiotico. L. fermentum TCUESC01 ha mostrato suscettibilità alla maggior parte degli antibiotici, ad eccezione degli inibitori della sintesi degli acidi nucleici (norfloxacina, ciprofloxacina, sulfonamide e cotrimossazolo) e di due inibitori della sintesi della parete cellulare (vancomicina e cefossina). Questi risultati confermano i dati pubblicati da Kirtzalidou et al. su 74 ceppi di Lactobacillus ssp. isolato da feci umane, di cui 94.il 5% dei ceppi era resistente all ‘amikacina, tutti erano resistenti alla kanamicina e alla ciprofloxacina, l’ 84,7% dei ceppi era resistente alla vancomicina, l ‘1,6% era resistente alla cefalotina e l’ 8,5% dei ceppi era resistente alla bacitracina. In generale, i lattobacilli mostrano resistenza intrinseca ai chinoloni, trimetoprim, sulfonamidi, vancomicina e la maggior parte degli inibitori dell’acido nucleico, mentre mostrano suscettibilità agli inibitori della sintesi proteica ad eccezione degli aminoglicosidi . Vale la pena notare che la resistenza agli antibiotici osservata qui è intrinseca al genere come evidente dagli studi pubblicati, e il trasferimento genico orizzontale è quindi raro. In sintesi, il profilo di resistenza di L. fermentum TCUESC01 supporta la possibilità di utilizzo insieme agli antibiotici che agiscono inibendo la sintesi degli acidi nucleici.

5. Conclusioni

Nonostante sia un ceppo extraintestinale isolato durante la fermentazione del cacao, L. fermentum TCUESC01 mostra un forte potenziale come probiotico per l’applicazione nei prodotti alimentari. Rimane vitale attraverso un ampio spettro di pH ed è quindi adatto per l’inclusione in diversi tipi di alimenti. Se conservato in un prodotto lattiero-caseario refrigerato, mantiene la vitalità al di sopra dei livelli raccomandati dalle organizzazioni nazionali e internazionali riconosciute fino alla data di scadenza del prodotto. In condizioni che imitano il transito gastrointestinale, sopravvive anche in quantità sufficienti per il mantenimento del potenziale probiotico. In termini di comportamenti previsti all’interno dell’intestino, L. fermentum TCUESC01 mostra una forte tendenza ad autoaggregarsi. Infine, questo ceppo presenta profili di suscettibilità e resistenza agli antibiotici che ne consentiranno l’uso insieme alle terapie farmacologiche. Nel loro insieme, queste caratteristiche suggeriscono che L. fermentum TCUESC01 ha un grande potenziale come additivo alimentare probiotico sicuro.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB). Il Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e la Coordinação de Aperfeiçoamento De personnels de niveau Superior (CAPES) hanno fornito produttività e borse di studio per alcuni autori.