Purificazione e caratterizzazione di asparaginasi da semi di Phaseolus vulgaris

Abstract

L-asparaginasi da batteri è stata utilizzata nel trattamento della leucemia linfoblastica acuta. Lo scopo di questo studio era quello di purificare e caratterizzare L-asparaginasi dai semi di Phaseolus vulgaris invece di fonti microbiche. La L-asparaginasi è stata purificata fino all’apparente omogeneità. L’enzima ha una massa molecolare di 79 kDa. L’asparaginasi purificata aveva un’attività molto bassa verso un certo numero di analoghi dell’asparagina e della glutammina. La L-asparaginasi era priva di attività glutaminasica. I parametri cinetici, Km e Vmax dell’enzima purificato, sono risultati essere rispettivamente di 6,72 mm e 0,16 µM. L’enzima aveva un pH ottimale a 8,0. L’enzima ha mostrato un’elevata stabilità a pH alcalino (pH 7,5–9,0) quando incubato fino a 24 ore. L-asparaginasi aveva la stessa temperatura ottimale e stabilità termica a 37°C. K+ è stato in grado di migliorare notevolmente l’attività di asparaginasi del 150% rispetto ad altri metalli testati. In conclusione, L-asparaginasi non ha mostrato alcuna attività glutaminasi e buona stabilità su una vasta gamma di condizioni fisiologiche, e quindi potrebbe essere utilizzato come potenziale candidato per il trattamento della leucemia linfoblastica acuta.

1. Introduzione

La L-asparaginasi (L-asparagina amidoidrolasi E. C. 3.5.1.1) è utilizzata nel trattamento della leucemia linfoblastica acuta e del linfoma non Hodgkin . L’uso della L-asparaginasi nella terapia antitumorale si basa sulla sua capacità di fendere la L-asparagina, un aminoacido essenziale per la crescita dei linfoblasti, all’ammoniaca e all’acido L-aspartico nel siero e nel liquido cerebrospinale, poiché i linfoblasti non sono in grado di produrre L-asparagina endogena che porta alla morte di queste cellule . La maggior parte delle cellule tumorali dipendono da una fonte esogena di questo amminoacido per la sopravvivenza. Tuttavia, le cellule normali sono in grado di sintetizzare L-asparagina e quindi sono meno colpite dal suo rapido esaurimento dovuto al trattamento con questo enzima. La L-asparaginasi può anche essere utilizzata per ridurre la formazione di acrilammide in cibi fritti e cotti al forno, specialmente nelle patatine . La formazione di acrilammide è stata attribuita alla reazione di asparagina libera e zuccheri riduttori . La deplezione di asparagina da parte dell’asparaginasi ha impedito la formazione di acrilammide .

La L-asparaginasi è ampiamente distribuita tra piante, animali e microrganismi . Nella pianta, questo enzima è stato rilevato per la prima volta nei semi in via di sviluppo di Lupinus albus . L’asparaginasi è stata anche purificata dalla testa dei semi maturi di L. polyphyllus . Sono state identificate due forme dell’enzima. Una forma K + – indipendente si trova in L. arboreus e L. polyphyllus e una forma K + – dipendente si trova in Pisum sativum e diverse altre specie di legumi, tra cui altre specie di Lupinus . Il lavoro con gli anticorpi alla forma K+-indipendente da L. polyphyllus non ha rivelato alcuna reazione crociata con l’asparaginasi del pisello o un certo numero di varietà di Lupino contenenti l’enzima K+-dipendente, suggerendo che le due forme di asparaginasi sono immunologicamente distinte .

Sono state riportate pochissime informazioni sull’uso dell’asparaginasi vegetale nel trattamento della leucemia linfoblastica acuta . Pertanto, l’obiettivo principale di questo studio era quello di purificare e caratterizzare la L-asparaginasi dai semi di Phaseolus vulgaris privi di L-glutaminasi invece di L-asparaginasi da fonti microbiche che viene utilizzata come antitumorale e ha causato effetti collaterali a causa delle sue risposte immunologiche.

2. Materiali e metodi

2.1. Materiali vegetali

Semi maturi di Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 sono stati ottenuti dal Centro di ricerca agricola, Il Cairo, Egitto.

2.2. Purificazione di Asparaginasi

2.2.1. Estratto grezzo

L’estratto grezzo di asparaginasi è stato preparato mediante omogeneizzazione di 50 g di semi di Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 in tampone Tris-HCl da 20 mm, pH 8,0 contenente 10% di glicerolo, 50 mm di KCl, 12,5 mm di β-mercaptoetanolo e 1 mM di PMSF. L’omogenato è stato centrifugato a 10.000 ×g e il surnatante è stato designato come estratto grezzo. L’estratto grezzo è stato concentrato per dialisi contro saccarosio solido.

2.2.2. Colonna di DEAE-Sepharose

L’estratto grezzo concentrato è stato applicato su una colonna di DEAE-Sepharose (15 × 1,6 cm i.d.) precedentemente equilibrata con tampone Tris-HCl da 20 mm, pH 8,0. L’enzima è stato eluito da diverse concentrazioni di KCl preparato nello stesso tampone ad una portata di 60 mL/h e sono state raccolte 3 ml di frazioni. Tre picchi di proteine sono stati eluiti con l’attività dell’asparaginasi secondo l’ordine di eluizione (asparaginasi I, II e III).

2.2.3. Sephacryl S-200

Asparaginasi I con la più alta attività è stata applicata su una colonna di Sephacryl S-200 (90 × 0.6 cm i. d.) che è stato precedentemente equilibrato con lo stesso tampone ad una portata di 30 mL/h e 3 ml frazioni sono stati raccolti.

2.3. Test Asparaginasi

L ‘ attività della L-asparaginasi è stata misurata con il metodo modificato di Wriston . La L-asparaginasi catalizza la L-asparagina in acido L-aspartico e ammoniaca e quest’ultima reagisce con il reagente di Nessler per produrre un prodotto di colore arancione. La miscela di dosaggio enzimatico consisteva in 900 µL di L-asparagina appena preparata (20 mm) in tampone Tris-HCl da 50 mm (pH 8,0), 50 mm KCl e 100 µL di estratto grezzo dell’enzima. La miscela di reazione è stata incubata a 37 ° C per 30 min e la reazione è stata interrotta aggiungendo 100 µL di acido tricloroacetico al 15%. La miscela di reazione è stata centrifugata a 10.000 ×g per 5 min a 4°C per rimuovere i precipitati. L’ammoniaca rilasciata nel surnatante è stata determinata utilizzando la tecnica colorimetrica aggiungendo 100 µL di reagente di Nessler nel campione contenente 100 µL di surnatante e 800 µL di acqua distillata. I contenuti nel campione sono stati vortexati e incubati a temperatura ambiente per 10 min e OD è stato misurato a 425 nm. L’ammoniaca prodotta nella reazione è stata determinata in base alla curva standard ottenuta con solfato di ammonio. Un’unità di attività della L-asparaginasi è definita come la quantità dell’enzima che libera 1 µmol di ammoniaca al minuto a 37°C.

2.4. Determinazione della proteina

La proteina è stata quantificata con il metodo di Bradford con albumina sierica bovina come standard.

2.5. Determinazione del peso molecolare

Il peso molecolare nativo è stato determinato da Sephacryl S-200. La colonna è stata calibrata con citocromo C (12.400), anidrasi carbonica (29.000), albumina sierica bovina (67.000), alcool deidrogenasi (150.000) e β-amilasi (200.000). Dextran blue (2.000.000) è stato utilizzato per determinare il volume vuoto (Vo). Il peso molecolare della subunità è stato stimato mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide . SDS-denaturato fosforilasi b (94.000), albumina sierica bovina (67.000), ovalbumina (43.000), anidrasi carbonica (30.000), inibitore della tripsina di soia (20.000), e α-lattoalbumina (14.200) sono stati utilizzati per la curva di calibrazione.

2.6. Caratterizzazione di Asparaginasi

2.6.1. La specificità del substrato

L’attività dell’asparaginasi è stata determinata con alcuni analoghi della L-asparagina. L’attività relativa è stata espressa come il rapporto percentuale tra l’attività enzimatica determinata rispetto a diversi analoghi della struttura di L-asparagina e l’attività enzimatica con L-asparagina.

2.6.2. Parametri cinetici

I valori delle costanti di Michaelis (Km) e della velocità massima (Vmax) sono stati determinati utilizzando L-asparagina come substrato nell’intervallo 2-20 mm. I parametri cinetici sono stati determinati dal grafico Lineweaver-Burk.

2.6.3. Effetto del pH

Il pH ottimale per l’attività dell’asparaginasi è stato determinato analizzando l’attività a diversi valori di pH. La stabilità del pH è stata testata mediante incubazione dell’enzima a pH di 5,0–9,0 per 24 ore a 4°C in assenza di substrato e l’attività residua è stata determinata nelle condizioni di analisi standard.

2.6.4. Effetto della temperatura

La temperatura ottimale per l’attività dell’asparaginasi è stata determinata analizzando l’enzima a temperature diverse. La stabilità al calore è stata misurata incubando l’enzima da solo a temperature diverse per 1 h. Dopo il trattamento termico, la soluzione enzimatica è stata raffreddata e l’attività residua è stata analizzata dopo aver aggiunto i substrati.

2.6.5. Effetto ioni metallici

Gli effetti di vari ioni metallici sull’attività enzimatica sono stati determinati preincubando l’enzima da solo con ioni metallici da 10 mm per 15 minuti prima di aggiungere il substrato. L’attività che è stata valutata in assenza di ioni metallici è stata presa come 100%.

3. Risultati e discussione

I risultati delle fasi di purificazione di asparaginasi da P. vulgaris sono riassunti nella Tabella 1. Il profilo di eluizione della cromatografia sulla colonna DEAE-Sepharose (Figura 1) ha mostrato tre picchi di proteine con attività asparaginasi. Picco uno con la più alta attività asparaginasi è stato applicato su una colonna S-200 Sephacryl (Figura 2). L-asparaginasi I è stata purificata 21,7 volte con un’attività specifica 846 unità / mg di proteina. L’asparaginasi I è stata dimostrata pura dopo la colonna S-200 di Sephacryl come valutato da SDS-PAGE (Figura 3). Il peso molecolare dell’asparaginasi I mediante le procedure S-200 e SDS-PAGE di Sephacryl ha prodotto un valore di 79 kDa come subunità monomerica. Questo risultato è in accordo con i pesi molecolari per le asparaginasi di Vigna unguiculata (70 kDa) e Lupinus polyphyllus (75 kDa) . Un peso molecolare medio di 58 kDa è stato rilevato per asparaginasi dalle foglie di pisello . Per le asparaginasi batteriche, il peso molecolare variava da 140 a 160 kDa con subunità tetrameriche . Un peso molecolare molto basso di 11,2 kDa è stato rilevato per Streptobacillus sp. KK2S4 asparaginasi .

Figura 1

Un tipico profilo di eluizione per la cromatografia di asparaginasi da P. vulgaris su colonna DEAE-Sepharose (15 × 1,6 cm i. d.) precedentemente equilibrato con tampone Tris-HCl da 20 mM, pH 8,0 ad una portata di 60 mL/h e 3 ml di frazioni.

Figura 2

Filtrazione in gel di asparaginasi I dalla frazione DEAE-Sepharose su colonna Sephacryl S-200 (90 × 1,6 cm i. d.). La colonna è stata bilanciata con tampone Tris-HCl da 20 mm, pH 8,0 ad una portata di 30 mL/h e 3 ml di frazioni.

Figura 3

SDS-PAGE per la determinazione dell’omogeneità e del peso molecolare dell’asparaginasi I da Phaseolus vulgaris. (1) Marcatori proteici; (2) Sephacryl S-200 asparaginasi I.

La specificità del substrato dell’asparaginasi I è stata esaminata utilizzando un certo numero di analoghi dell’asparagina e della glutammina (Tabella 2). L’attività con la L-asparagina è stata considerata come attività al 100%. La DL-asparagina ha mostrato il 30% dell’attività enzimatica, dove la DL-asparagina è composta da un 1 : 1 miscela racemica. Gli analoghi della D-asparagina, dell’acido L-aspartico e dell’acido L-glutammico avevano un’attività molto bassa verso l’asparaginasi I. Nessuna attività è stata rilevata in presenza di L-glutammina. Pertanto, l’asparaginasi I di P. vulgaris è priva di glutaminasi. La contaminazione dell’asparaginasi con l’attività della glutaminasi ha causato effetti collaterali durante il corso della terapia antitumorale . La L. arboreus asparaginasi ha idrolizzato solo L-asparagina e DL-aspartil idrossamato . La V. unguiculata asparaginasi era specifica per la L-asparagina, non idrolizzava la D-asparagina e non era specifica per la L-glutammina .

I parametri cinetici, Km e Vmax dell’enzima purificato, sono risultati essere 6,72 mm asparagina e 0,16 µM ammoniaca/mL, rispettivamente (Figura 4). Valori Km simili di 6,6 e 7,0 mm sono stati determinati per le asparaginasi di L. arboreus e L. angustifolius, rispettivamente . L’asparaginasi dei semi di Lupinus ha un alto Km per l’asparagina (12,2 mm) . Basso Km (1.2 mm) è stato determinato per asparaginasi da V. unguiculata . Per i batteri, i valori Km per L-asparaginasi da Escherichia coli e Erwinia carotovora sono stati rispettivamente di 3,5 e 7,14 mm .

Figura 4

Lineweaver-Burk trama relativa di asparaginasi I da velocità P. vulgaris a diverse concentrazioni di L-asparagina.

Asparaginasi I ha mostrato un pH ottimale a 8.0 (Figura 5). Tra pH 6.0 e 9.0, è stato mantenuto più del 50% della sua attività. Sebbene l’attività massima a pH fisiologico sia uno dei prerequisiti della L-asparaginasi per l’attività antitumorale, l’enzima purificato sarebbe utile perché l ‘ 80% dell’attività enzimatica è stata mantenuta a pH 7,5. L’enzima ha mostrato stabilità a pH alcalino (pH 7,5–9,0) in quanto ha mantenuto il 90% della sua attività originale quando incubato fino a 24 h (Figura 6). Tuttavia, il pH ottimale delle L-asparaginasi di diverse piante variava da 8,0 a 8,5 . La maggior parte delle L-asparaginasi dei batteri ha mostrato un pH alcalino optima (8,0–10) .

Figura 5

pH ottimale di asparaginasi I da P. vulgaris. L’attività enzimatica è stata misurata a vari pH utilizzando il metodo di analisi standard come descritto in precedenza.

Figura 6

pH stabilità di asparaginasi ho da P. vulgaris a diverso pH dopo incubazione per 24 ore a 4°C.

Asparaginasi mi è stato trovato per avere la temperatura ottimale di 37°C (Figura 7). Temperatura ottimale simile di asparaginasi da V. unguiculata (40°C) è stata riportata . Questa temperatura era anche simile a quella riportata per Pseudomonas aeruginosa e Pectobacterium carotovorum . L’attività ottimale di Streptobacillus sp. asparaginasi è stata registrata a 35°C. Al contrario, la L-asparaginasi di Chrombacteriaceae e Proteus vulgaris è stata osservata rispettivamente a 20°C e 57°C. È stata rilevata una relazione non lineare tra asparaginasi I e stabilità della temperatura (Figura 8). L’attività enzimatica era stabile fino a 37 ° C dopo incubazione per 1 h. Asparaginasi da V. unguiculata era stabile fino a 40°C dopo incubazione per 15 min . Le asparaginasi di P. carotovorum e C. annuum hanno mantenuto la loro attività iniziale dopo incubazione a 40°C e 45°C per 60 min, rispettivamente .

Figura 7

Temperatura ottimale di asparaginasi I da P. vulgaris. L’attività enzimatica è stata misurata a varie temperature utilizzando il metodo di analisi standard come descritto in precedenza.

Figura 8

Stabilità termica di asparaginasi I da P. vulgaris. La miscela di reazione è stata preincubata a varie temperature per 60 min prima dell’aggiunta del substrato, seguita dal raffreddamento in un bagno di ghiaccio. L’attività enzimatica è stata misurata utilizzando il metodo di dosaggio standard come descritto in precedenza. L’attività a tempo zero è stata presa come attività al 100%.

È stato esaminato l’effetto di diversi ioni metallici sull’asparaginasi I (Tabella 3). Gli ioni metallici sono stati utilizzati alla concentrazione di 10 mM. K + è stato in grado di migliorare notevolmente l’attività dell’asparaginasi I del 150%. Nella pianta sono state identificate asparaginasi K + – indipendenti e K+-dipendenti . K + ha agito anche come potenziatore su P. carotovorum asparaginasi . Ca2 + ha leggermente migliorato l’attività del 110%, ma Cu2+ ha leggermente inibito l’attività dell’asparaginasi I. Inoltre, Pb2+ e Hg2+ hanno causato un effetto parzialmente inibitorio sull’asparaginasi I. Tuttavia, V. unguiculata asparaginasi è stata attivata da Ni2+ e Co2+ ed è stata inibita da Mn2+, Zn2+, Ba2+ e Hg2+ . L’EDTA come agente chelante metallico ha causato un effetto parzialmente inibitorio sull’asparaginasi I. Tuttavia, l’EDTA non ha avuto alcun effetto sulla P. carotovorum asparaginasi .

4. Conclusioni

La L-asparaginasi I di P. vulgaris è stata purificata in forma libera da glutaminasi, che può ridurre la possibilità di effetti collaterali durante il corso della terapia antitumorale. L’enzima ha mostrato una buona stabilità in una vasta gamma di condizioni fisiologiche come pH e temperatura. Nella fase successiva del nostro progetto, la L-asparaginasi I di P. vulgaris sarà utilizzata come potenziale candidato per il trattamento della leucemia linfoblastica acuta.

Conflitto di interessi

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi rilevanti per questo documento da rivelare.

Riconoscimenti

Questo progetto è stato finanziato dal Piano Nazionale per la Scienza, la Tecnologia e l’Innovazione (MAARIFAH), King Abdulaziz City for Science and Technology, Arabia Saudita, premio n. (11-BIO-1516-03). Gli autori riconoscono anche con Unità di Scienza e Tecnologia grazie, King Abdulaziz University, per il supporto tecnico.