Rigenerazione renale con cellule staminali: Una panoramica

Abstract

Background: La rigenerazione renale sta attualmente guadagnando notevole attenzione al posto della dialisi renale come strategia terapeutica definitiva per l’insufficienza renale. Tuttavia, a causa di complicazioni anatomiche, si ritiene che il rene sia l’organo più difficile da rigenerare. Un organo così complicato è praticamente impossibile immaginare di essere completamente ricostruito de novo dalle cellule staminali. Tuttavia, diversi gruppi di ricerca stanno tentando questa grande sfida. Sommario: Ci sono 4 strategie principali per la rigenerazione de novo del rene dalle cellule staminali. Queste strategie includono l’uso di: (i) un’impalcatura cadaverica decellularizzata, (ii) decomplementazione della blastocisti, (iii) una nicchia nefrogenica per la coltivazione di uno xeno-embyro e (iv) potenziale di auto-assemblaggio. Tutte queste strategie possono essere applicabili in ambito clinico, ma sembra essere necessario un periodo di preparazione sostanziale. Messaggi chiave: Anche se rimangono molti problemi in sospeso per la rigenerazione renale, comprese le questioni etiche e la formazione di strutture chimeriche, gli studi forniscono speranza per i pazienti in dialisi e la rigenerazione renale dovrebbe essere una realtà in futuro.

© 2014 S. Karger AG, Basel

Introduzione

Il rene conserva il potenziale di rigenerazione se il danno non è troppo grave e la struttura renale rimane intatta. Tuttavia, in caso di danni irreversibili al rene, come può verificarsi con la dialisi a lungo termine, la proprietà di auto-rinnovamento è totalmente persa. Pertanto, qualsiasi applicazione della medicina rigenerativa in pazienti dializzati richiederà lo sviluppo de novo di un intero rene funzionale.

In termini di rene intero funzionale, Chan et al. riportato il primo tentativo di sviluppare un’intera unità renale funzionale formando un pronephros trapiantabile da tappi animali in Xenopus. Il trapianto di questa unità simile a pronephros ha almeno parzialmente corretto l’edema nei girini nefrettomizzati bilateralmente e sono sopravvissuti fino a 1 mese. Per quanto ne sappiamo, questo studio è l’unico in cui è stata sviluppata de novo un’unità renale intera funzionale trapiantabile. Tuttavia, la struttura pronephros formata in questo studio era troppo primitiva per qualsiasi applicazione clinica negli esseri umani. Da allora, molti tentativi sono stati fatti in tutto il mondo per rigenerare interi reni de novo (applicabili nei mammiferi) dalle cellule staminali.

Ricostruzione di rene intero utilizzando un’impalcatura cadaverica decellularizzata

È stato riportato che le impalcature cadaveriche decellularizzate possono fornire una nicchia per le cellule staminali per differenziarsi in organi interi. Questa strategia è stata utilizzata da Ott et al. per sviluppare con successo un cuore di ratto artificiale funzionale. Un’impalcatura a cuore intero con una geometria tridimensionale (3D) intatta e una vascolarizzazione è stata creata tramite perfusione coronarica con detergenti nel cuore cadaverico, seguita da ripopolamento con cellule cardiache neonatali o cellule endoteliali aortiche di ratto . Le cellule cardiache neonatali iniettate formavano un miocardio contrattile, che eseguiva la funzione di ictus. Questa strategia è stata anche impiegata per sviluppare fegato e polmoni trapiantabili utilizzando rispettivamente epatociti maturi e cellule epiteliali alveolari . Sono stati fatti diversi tentativi per utilizzare questa tecnica per la rigenerazione renale. Questi tentativi hanno rivelato che le cellule staminali pluripotenti infuse erano localizzate alla vascolarizzazione e ai glomeruli, con successiva migrazione nei tubuli, ma era difficile acquisire la funzione renale . Tuttavia, recentemente lo stesso gruppo, che ha utilizzato con successo il metodo sopra descritto per generare cuore e polmoni, ha riportato una rigenerazione renale completa di successo, che può produrre urina dopo il trapianto . In particolare, hanno usato cellule endoteliali della vena ombelicale umana ben differenziate invece di cellule staminali pluripotenti, e l’uso di solo un’impalcatura ha fornito loro selettivamente una nicchia per la diversione differenziata delle cellule residenziali renali e vascolari nell’area destra. Anche se non è chiaro come le cellule infuse si differenziano e orchestrano in nefroni con vascolarizzazione per produrre urina, questa tecnica potrebbe essere una soluzione per la carenza di organi donatori.

Integrazione di blastocisti

L’iniezione di cellule staminali embrionali normali (ES) nelle blastocisti di topi carenti del gene 2 che attivano la ricombinazione, che non hanno linfociti B o T maturi, genera chimere somatiche con cellule B e T mature derivate dalle cellule ES . Questo sistema di “blastocisti” è stato recentemente applicato alla ricostruzione dell’intero organo. Kobayashi et al. recentemente è stata riportata una rigenerazione di successo di un pancreas di ratto nel topo tramite un’iniezione interspecifica di blastocisti di cellule staminali pluripotenti indotte (iPS). Hanno iniettato cellule iPS di ratto nel Pdx-1-/- (pancreatogenesis-disabled) blastocisti del topo e ha scoperto che le chimere appena nate del ratto e del topo hanno elaborato un pancreas quasi interamente derivato dall’iPS. Questo successo dimostra che quando viene fornita una nicchia di sviluppo vuota per un organo, la progenie cellulare derivata dalle cellule iPS può occupare quella nicchia e compensare in modo evolutivo i contenuti mancanti della nicchia. Questo forma un organo complicato composto quasi interamente da cellule derivate da cellule iPS donatrici, anche se la complementazione dei blastociti coinvolge specie diverse. Quel gruppo di ricerca ha recentemente generato un Pdx-1-/- maiale ed è riuscito a generare un pancreas più grande utilizzando questa tecnica . Questi risultati di successo suggeriscono che gli organi su scala umana potrebbero teoricamente essere generati de novo.

Questa tecnica è stata recentemente applicata alla ricostruzione renale intera . Dopo l’iniezione di cellule iPS di topo nelle blastocisti di topi Sall1-null, che mancano di entrambi i reni, la maggior parte dei metanefroi consisteva in cellule differenziate derivate da cellule iPS. Tuttavia, non hanno potuto ottenere il bambino nel bestiame dopo questa manipolazione per una ragione sconosciuta, suggerendo che c’è un altro problema da risolvere in questo sistema per la rigenerazione renale. Tuttavia, questi risultati suggeriscono fortemente che la complementazione della blastocisti è una strategia più promettente per la rigenerazione del rene. Questi sistemi non sono disponibili per l’uso clinico in questo momento perché non è possibile generare sistemi vascolari e nervosi. Inoltre, importanti questioni etiche con la manipolazione delle blastocisti con cellule iPS rimangono irrisolte . Tuttavia, questo successo evidenzia la logica secondo cui l’eventuale applicazione clinica della rigenerazione renale deve dipendere dalla programmazione dello sviluppo.

È stato tentato l’uso di una nicchia nefrogenica per la coltivazione di Xeno-embrioni (Metodo di nicchia organogenica)

La rigenerazione di un intero rene funzionale utilizzando un embrione eterozoico in via di sviluppo come “fabbrica di organi”. Questo si basa sul concetto di “prendere in prestito” il programma di sviluppo di uno xeno-embrione in crescita applicando cellule staminali nella nicchia dell’organogenesi. Durante lo sviluppo del metanefros, il mesenchima metanefrico si forma inizialmente dalla porzione caudale del cordone nefrogenico e secerne il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF). Questo processo induce il vicino dotto wolffiano a produrre un germoglio ureterico. I ricercatori hanno microiniettato le cellule staminali mesenchimali umane che esprimono GDNF (hMSCs) nel sito di germogliamento dopo questo processo . L’embrione ricevente è stato coltivato in un intero sistema di coltura embrionale e il metanefros formato è stato sviluppato nella coltura dell’organo. La manipolazione senza virus può anche essere eseguita utilizzando un polimero GDNF termoreversibile . Di conseguenza, gli HMSC donatori sono stati integrati nei metanefros rudimentali e morfologicamente differenziati in cellule epiteliali tubulari, cellule interstiziali e cellule epiteliali glomerulari . I ricercatori hanno quindi trapiantato il metanefros sviluppato nell’omento per consentire l’integrazione vascolare dal ricevente per formare un nefrone funzionale. Di conseguenza, è stato generato un ‘neokidney’ derivato da hMSC, che conteneva un nefrone umano e la vascolarizzazione dall’ospite . Inoltre, il neokidney ha prodotto urina che ha mostrato concentrazioni più elevate di azoto ureico e creatinina rispetto ai sieri del ricevente. Questa scoperta ha suggerito che il neokidney che si è sviluppato nell’omento era in grado di produrre urina filtrando il sangue del ricevente . Inoltre, la neokidney derivata da hMSC secerneva eritropoietina umana e la sua produzione era stimolata dall’induzione di anemia nell’animale ospite . Questo risultato ha indicato che questo sistema mantiene la normale regolazione fisiologica dei livelli di eritropoietina. Tuttavia, il sistema attuale non può ricostruire i derivati del germoglio ureterico. Pertanto, per determinare se le MSC possono differenziarsi nel progenitore ureterico del germoglio utilizzando embrioni di pulcino, le HMSC che esprimono Pax2 sono state iniettate nella regione progenitrice ureterica del germoglio del pollo . Di conseguenza, migrarono caudalmente con il dotto wolffiano allungante e furono integrati negli epiteli del dotto wolffiano e quindi espressi LIM1. Questa scoperta ha dimostrato che possono differenziarsi in cellule del dotto wolffiano sotto l’influenza di xeno-segnali locali . Questi risultati suggeriscono che un rene intero può essere ricostruito trapiantando hMSCs in un momento e un luogo adatti per rigenerare i derivati del mesenchima metanefrico e del germoglio ureterico.

Sulla base dei nostri risultati di successo, stiamo attualmente studiando la possibilità di sperimentare su un animale più grande (cioè il maiale) perché il rene suino ha quasi lo stesso volume del rene umano. La dimensione finale del metanefros sviluppato sembra essere impressa durante le prime fasi di sviluppo nell’embrione ospite. Questa possibilità è supportata dalla scoperta che i metanefroi di animali più grandi trapiantati negli omenta di ospiti più piccoli si sviluppano in organi con un volume (diametro e peso) più grande rispetto a quello di un normale rene ospite . Speriamo che questo sistema faciliterà lo sviluppo di organi più grandi che sono più adatti per l’uso negli esseri umani (fig. 1).

Auto-Assemblaggio Potenzialità delle Cellule Staminali

Alcuni ricercatori hanno suggerito che le cellule staminali pluripotenti hanno la potenzialità di differenziarsi in cellule mature e assemblarsi in tessuti o organi, che hanno condotto le indagini utilizzo di cellule staminali pluripotenti per generare cellule mature in vitro. È stata dimostrata la formazione autonoma di tessuto 3D simile all’adenoipofisi , al cappuccio ottico e alle strutture tissutali intestinali utilizzando un sistema di coltura cellulare 3D ES da cellule es. Questo approccio potrebbe ridurre sostanzialmente la complessità dell’organogenesi per la rigenerazione terapeutica. Per rigenerare le cellule renali utilizzando tale approccio, le cellule ES o iPS devono essere differenziate in mesoderma intermedio e quindi progenitori renali, seguiti da diversi tipi di cellule renali. Per quanto riguarda la rigenerazione renale, Osafune et al. dimostrato che una singola cellula progenitrice multipotente da un rene di topo embrionale, che esprime altamente Sall1, potrebbe differenziarsi in diversi tipi di cellule renali, compresi i podociti glomerulari e gli epiteli tubulari renali, e alla fine ricostruire una struttura renale 3D. Un altro studio recente ha riportato sospensioni monocellulari da reaggreganti renali embrionali per formare strutture renali organotipiche . Durante lo sviluppo, il rene deriva dal mesoderma intermedio, uno dei primi strati germinali. Le cellule mesodermiche intermedie si differenziano quindi in progenitori renali, seguiti da diversi tipi di cellule renali. Pertanto, se le cellule ES o iPS possono differenziarsi prima in mesoderma intermedio e poi in progenitori renali, è possibile che tutti i tipi di cellule renali possano essere generati utilizzando cellule staminali pluripotenti. Osafune et al. hanno stabilito metodi per differenziare le IPSC umane in cellule mesodermiche intermedie utilizzando un trattamento combinato di fattori di crescita . Queste cellule esprimono i geni intermedi dell’indicatore del mesoderma e potrebbero maturare nei tipi multipli delle cellule, compreso quelli trovati negli organi intermedi mesoderma-derivati quali il rene, le gonadi e la corteccia surrenale. Queste indagini suggeriscono che, se queste cellule mesodermiche intermedie possono differenziarsi in cellule progenitrici renali, una struttura renale 3D può essere costruita da cellule staminali pluripotenti. I mezzi per rigenerare con successo un sistema vascolare funzionale tra il rene rigenerato e il ricevente rimangono sconosciuti. Inoltre, la funzione in vivo di un rene rigenerato non è chiara. Tuttavia, ulteriori progressi nella biologia dello sviluppo possono risolvere questi problemi e consentire la rigenerazione del rene intero in vitro.

Conclusione

Questo articolo riassume le ultime indagini sull’uso delle cellule staminali per rigenerare un rene intero funzionale de novo. Nonostante molti progressi biologici e tecnici nella rigenerazione renale, la ricostruzione di un rene completamente funzionale rimane fuori dalla portata e molti problemi sono ancora irrisolti. L’uso di tessuto eterologo, come xeno-metanefroi e xeno-blastocisti, solleva problemi etici, mentre i metodi per differenziare in modo affidabile ESCs/iPSCs nei reni in vitro non sono stati completamente stabiliti. Devono ancora essere sviluppati metodi per garantire la funzione del tessuto renale rigenerato per produrre urina ed eritropoietina. Tuttavia, i continui sforzi nelle cellule staminali e nella biologia dello sviluppo si spera risolveranno questi problemi, portando allo sviluppo di nuove strategie di trattamento per ricostruire un intero rene con un’adeguata funzionalità renale. Crediamo che tali sforzi si concretizzeranno e sarà possibile rigenerare un rene funzionale in futuro.

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