Test di chinasi
Preparato da Swathi Arur
Protein chinasi (soluzioni stock di 1-10 mg/ml di chinasi pure) – per questi test, uso la chinasi ERK2 purificata (NEB). Per ogni enzima, è importante determinare il buffer ottimale, la forza ionica e il pH per l’attività. Se queste condizioni non sono state stabilite, il protocollo elencato di seguito può essere utilizzato come punto di partenza.
Substrato (soluzione madre di 10 mm) – I substrati contengono tipicamente una Serina /treonina in un motivo del sito di fosforilazione. Come controllo uso la proteina basica della mielina (ottenuta da Sigma), che è stata usata da NEB per calibrare la chinasi ERK2.
Inoltre, i substrati dovrebbero avere una carica positiva netta per facilitare il legame ai filtri della fosfocellulosa utilizzati nel saggio. Per il legame quantitativo con la carta fosfocellulosa, si raccomanda di avere almeno 2 residui di base e un terminale amminico libero. Se non è noto un motivo del sito di fosforilazione, è possibile utilizzare un substrato di tirosina chinasi generale. Ad esempio,” Myelin Basic Protein ” (è un substrato non specifico per molti MAPKs). Per le reazioni iniziali, deve essere utilizzata una concentrazione di substrato di 0,7-1,5 mm. Per determinare i parametri cinetici per la fosforilazione del peptide sintetico, è richiesto un intervallo di concentrazioni di peptidi
10X Tampone chinasi-contiene 5 mg/mL BSA (per prevenire l’adsorbimento della chinasi al tubo di analisi), 150 mm Tris-Cl (pH 7,5).
ATP / MgCl2 (acquistato da Upstate Biotech – Magnesium/ATP Cocktail # 20-113) – una soluzione stock di 1-5 mM è conveniente. Si noti che la maggior parte dei MAPK ha valori Km per ATP nell’intervallo 10-150 uM, quindi per gli esperimenti cinetici è importante utilizzare concentrazioni di saturazione di ATP per arrivare a valori di Km e Vmax per i peptidi.
ATP – 10 mCi/mL.
ERK2 Chinasi Dosaggi
a) AUTORADIOGRAFIA DOSAGGIO:
- standard saggio di chinasi, è realizzato in un volume di 25 ul:
- 2.5 ul di 10X chinasi buffer
- 5 ul di 1.0 mM MgCl2 /ATP (0,2 mM concentrazione finale)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul di 10 mM del substrato (1.Concentrazione finale di 2 mm)
- 1 U della chinasi ERK2
- H2O a 25 ul
1. Prima degli esperimenti, preparare un cocktail contenente abbastanza buffer, ATP e ATP per completare i test. Per i saggi a diverse concentrazioni di substrato, il substrato deve essere diluito e aggiunto separatamente a ciascun tubo. Dopo aver erogato il cocktail in provette per microcentrifuga da 1,5 ml, posizionare i tubi a bagnomaria a 30 gradi C per 30 minuti. Le reazioni devono essere iniziate con l’aggiunta di chinasi e lasciate procedere a 30 gradi C.
2. Dopo il tempo desiderato, terminare le reazioni aggiungendo 2 X buffer di campione SDS e esaurire su un gel.
3. Asciugare il gel su una carta Whatman 3.0, esporre il gel secco a un autoradiogramma e mantenere la cassetta a -70Cfor 2 ore. (per esposizioni più lunghe assicurarsi che il film sia nuovamente asciutto prima di inserire un nuovo autoradiogramma su di esso).
b) ANALISI CINETICA:
1. Condurre il test della chinasi come sopra, questa volta utilizzare diverse concentrazioni dei substrati a partire da 50nM a 1mM. Interrompere la reazione dopo 30 minuti aggiungendo 45 ul di acido tricloroacetico ghiacciato al 10% (TCA) a ciascuna reazione. Vortice le reazioni.
3. Girare per 2 minuti in microcentrifuga (10K rpm).
4. Spot 35 ul dei supernatanti su 2,1 cm di diametro Whatman P81 cerchi filtro fosfato di cellulosa.
6. Lavare i cerchi del filtro P81 tre volte con 500 ml di acido fosforico freddo allo 0,5% (5-10 minuti per lavaggio). L’avanzamento delle fasi di lavaggio può essere seguito rimuovendo il cerchio del filtro P81 per una reazione bianca e controllandolo con un contatore Geiger.
7. Lavare una volta con 200 ml di acetone a temperatura ambiente per 5 minuti.
8. Lasciare asciugare i cerchi del filtro a temperatura ambiente.
9. Mettere i cerchi del filtro nelle fiale di scintillazione e misurare l’incorporazione 32P contando le pastiglie asciutte in un contatore di scintillazione. L’attività specifica dell’ATP in una reazione di chinasi (ad esempio, in cpm/pmol) può essere determinata individuando un piccolo campione (2-5 ul) della reazione su un cerchio del filtro P81 e contando direttamente (nessun lavaggio). I conteggi al minuto ottenuti nella reazione di chinasi (meno bianco) vengono quindi divisi per l’attività specifica per determinare le talpe di fosfato trasferite nella reazione.
Cinetica della fosforilazione del substrato
I parametri cinetici per la fosforilazione di un substrato da parte di un MAPK possono essere determinati utilizzando una variazione del protocollo di cui sopra.
1. Effettuare una reazione ad alta concentrazione di substrato per stabilire che la proteina è un substrato.
2. Variare la concentrazione enzimatica nel test. Il tasso di fosforilazione del substrato deve essere proporzionale alla concentrazione enzimatica nelle condizioni del saggio. Questo esperimento viene anche utilizzato per determinare la quantità di enzima necessaria per gli studi cinetici.
Per determinare i tassi, deve essere effettuato un corso temporale di fosforilazione del substrato. In questo caso, preparare una reazione enzimatica più grande (usiamo 150 ul). Nei punti di tempo desiderati, prelevare 25 aliquote ul e trasferirle in provette per microcentrifuga contenenti 45 ul di TCA 10% ghiacciato e analizzare le reazioni come descritto sopra. La fosforilazione del substrato deve essere lineare nel tempo e per la misurazione delle costanti cinetiche devono essere utilizzate le velocità di reazione iniziali (5%).
3. Variare la concentrazione del substrato nel test. Utilizzare un grafico di velocità vs concentrazione peptide per ottenere una stima iniziale del valore di Km. Una vasta gamma di concentrazioni di substrato (ad esempio, da 20 uM a 2 mm) dovrebbe essere utilizzata in questa misurazione iniziale.
4. Per determinare Km (substrato) e Vmax , variare la concentrazione del substrato e misurare la velocità di trasferimento del fosfato. Una buona gamma di concentrazioni di substrato sono i seguenti multipli di Km: 0,125 x Km, 0,25 x Km, 0,5 x Km, 1,0 x Km, 2,0 x Km, 4,0 x Km, 8,0 x Km. Le reazioni devono essere eseguite in triplice copia per ottenere i migliori risultati.
5. Le costanti cinetiche sono determinate dai minimi quadrati non lineari ponderati che si adattano alla velocità iperbolica rispetto ai grafici utilizzando programmi iterativi come NFIT (Island Products, Galveston, TX).
CALCOLO di RAR:
RAR: Rapporto accettore relativo = Vmax / Km definito come una misura complessiva della capacità di una proteina di funzionare come substrato.
Normalizzo il RAR di un dato substrato con la proteina di base della mielina, cioè calcolo il valore di RAR per ciascun substrato e poi lo divido per il valore di RAR della proteina di base della mielina (impostando così MBP a 1.0).
